GELES DE AGAROSA

GELES DE AGAROSA:

Para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño (entre 0,5 y 30 Kb) se utiliza electroforesis en geles de agarosa de concentración variable 0.7 - 2.5%, en solución TAE 1X (Tris-HCl 40 mM, EDTA 2 mM, Acido Acético Glacial, pH 8,0). Los geles analíticos se realizan en forma horizontal, quedando estos sumergidos, es decir, cubiertos al menos por 2 mm de solución amortiguadora de electroforesis (TAE 1X).

Los geles se corren a 100 volt hasta la salida de la muestra del pocillo e ingreso de esta al gel, y 70 volt. para su desplazamiento a través de este. Usando TAE 1X como amortiguador de corrida. Las muestras son cargadas en volúmenes de 6 μl más 2 μl de loading buffer ( Glicerol 25%, Azul de Bromofenol 0,025% y EDTA 12 mM).

El ADN se observa posteriormente en un trans-iluminador UV, luego de haber incubado el gel durante 15 minutos en una solución de Bromuro de Etidio 0,5 μg/ml.

GELES DE POLIACRILAMIDA:

Para separar los fragmentos de ADN de menor tamaño, se usan geles de poliacrilamida desde 5% al 10% (dependiendo del tamaño de fragmentos estudiados). La solución madre contiene 30% de acrilamida y 1% de Bis-acrilamida.

Para la preparación 100 ml de solución madre (10%) se agrega Acrilamida / Bis-Acrilamida (30:1), 10 ml de TBE 10X (Tris-HCl 0,9 M pH 8,0 ; Acido Bórico 0,9 M y EDTA 20 mM pH 8,0); 36 gr de Urea y 84,4 ml de agua bidestilada. Una vez disuelto todos los componentes se procede a filtrar la solución (utilizar papel filtro de 0.2 μm) posteriormente almacenar a 4 oC.

POLIACRILAMIDA 10% (100 ml)

ACRILAMIDA 9.678 g

BIS-ACRILAMIDA 0.322 g

UREA 36 g

AGUA 84.4 ml

TBE 10% 10 ml

100 ml

Para la preparación del gel de secuencia desgasificar 60 ml de solución madre, posteriormente agregar 50μl de TEMED (4 oC). y 300 μl de Persulfato de Amonio (10%), depositar esta solución entre las placas de vidrio (utilizando una jeringa), una vez depositado el gel entre los vidrios colocar en la parte superior la peineta en posición invertida (con los dientes hacia arriba). Dejar polimerizar 1 a 2 horas. Una vez polimerizado, se precorre por 40 min a 500 Volt. Una vez precorrido el gel denaturar las muestras (5 μl de muestra + 2 μl loading buffer PAGE, 95 oC ). Luego volver la peineta a su posición original (con los dientes hacia abajo) teniendo la precausión de no romper el gel; limpiar los pocillos y cargar las muestras. Correr las muestras toda la noche a 500 volt. (o 5 horas a 1400 Volt)

El gel se corre en forma vertical y como solución de corrida utilizar solución amortiguadora TBE 1X. La electroforesis se realiza hasta que el Loading

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