Manual Microbiología general

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OBJETIVOS

-Preparación de medios de cultivo selectivos en pico de flauta.

-Aprender técnicas de inoculación en este tipo de medios.

-Reconocer los microorganismos inoculados dependiendo del tipo de reacción que indique el medio.

FUNDAMENTO

Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento. Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para detectar la producción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas.

INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, antibióticos, etc., a la concentración adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados microorganismos.

El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).

Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de esta. Las actividades que se evalúan con mayor frecuencia en las pruebas bioquímicas son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas hidrolíticas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etcétera. En esta práctica, se procedió a la identificación de algunos microorganismos por los indicativos que presentaron en los medios de cultivo correspondientes.

MATERIALES

• 1 gradilla 2 pipetas de 5 ml.
• 1 vaso de precipitado de 50 ml.
• 1 asa de siembra
• 1 plancha de agitación
• 5 tubos de ensayo
• Autoclave
• Balanza analítica
• 5 matraces Erlenmeyer
• 1 piseta
• 1 mechero de alcohol

Reactivos

• Medios de cultivo: Citrato Simmons, SIM, MIO, Hierro Kligler y caldo nutritivo.
• Alcohol etílico
• Heces fecales
• Agua destilada

Metodología

• Preparar los medios de cultivo como se indique para cada uno en las etiquetas. Hacer los cálculos pertinentes para obtener 4 ml de cada medio:

Hierro Kligler:

Suspender  54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Citrato Simmons:

Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.

SIM:

Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto.

MIO

Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución.

Caldo nutritivo

Emplear 8 g de polvo por litro de agua destilada. Si es necesario, calentar hasta disolver.

• Verter 4 ml de cada medio en los tubos de ensayo.
• Esterilizar en la autoclave (121 ° C por 15 min).
• Dejar enfriar e inclinar los tubos para que el contenido se distribuya de menor a mayor a lo largo de la pared del tubo. Los medios líquidos pueden mantenerse verticales.

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Imagen 1. Material para inocular.

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Imagen 2. Medios antes de inocular. De arriba hacia abajo: Caldo nutritivo, MIO, SIM, Citrato de Simmons y Hierro de Kligler.

Inoculación

• Flamear el asa al rojo vivo y tomar una muestra (inóculo) del material a analizar (excremento).
• Abrir cerca del mechero de alcohol un medio (sin dejar la tapa lejos del mechero).
• Inocular cerca del mechero de la siguiente forma:

• Hierro Kligler y Citrato Simmons (medios sólidos):

Sembrar por picadura (introducir el asa con el inóculo en el medio y sacar) y estría (el inóculo se disemina con un movimiento hacia atrás y hacia adelante).

• SIM y MIO (medios semisólidos)

Sembrar por picadura.

• Caldo (medio líquido)

Por picadura y agitar (para liberar el inóculo).

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• Incubar a 32° C por 24 horas.
• Retirar de la incubadora y observar.
• Agregar unas gotas de reactivo de Kovacs a los medio SIM y MIO.

RESULTADOS

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