Manual de bioquimica metabolica Universidad de Sonora

Universidad de Sonora

Unidad Regional Sur

Departamento de Ciencias Químico Biológicas

y Agropecuarias

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Prácticas de Laboratorio

de Bioquímica Metabólica

Q.F.B. Eva Irma Vejar Rivera

INDICE

PRACTICA No. 1

OBTENCION DE ATP DEL MUSCULO DE CONEJO

INTRODUCCION

        Los derivados fosforilados, juegan un papel muy importante en las transferencias energéticas de los organismos vivos. La unidad básica de energía en toda escala filogenética de seres vivos es la Adenosina Trifosfato, comúnmente conocida como ATP.

        La importancia de los fosfatos orgánicos en el metabolismo fue escrita por Harden y Young en sus estudios de fermentación, que tuvieron como consecuencia el aislamiento de metabolitos como glucosa- 6- fosfato, fructosa -6- fosfato, fructosa 1,6- difosfato. Embden, Mayerhoff, Parmas y Cori señalaron que estos metabolitos también eran intermediarios en el metabolismo del glucógeno y de la glucosa en el músculo y otros tejidos. Fiske y Subbarow y Engleton  descubrieron la creatina- fosfato en el músculo de los vertebrados, Meyerhoff y Ruranyi encontraron que la rotura enzimática de la creatina-fosfato liberaba mucha energía. Lundsgaard mostró que la energía producida en la contracción muscular era aproximadamente equivalente a la energía liberada en la ruptura de la creatina-fosfato.

En 1931 Lohmann aisló por primera vez el ATP a partir del músculo. Originalmente lo llamó “adenilpirofosfato”, y encontró que se obtenía mucha energía cuando se hidrolizaban los grupos fosfato terminales del ATP.

Meyerhoff pudo preparar extractos de músculo en solución isotónica fría de cloruro de potasio, y que contenía todo el sistema enzimático para romper el glucógeno rápidamente a ácido láctico, y también para romper la creatina fosfato y el ATP. Lohmann entonces demostró que la descomposición del ATP precede a la rotura de la creatina fosfato y que la rotura de ésta se debe no a la hidrólisis sino a la reacción con el ADP formado en la descomposición del ATP. Esta reacción es reversible y se conoce como la reacción de Lohmann. De estos estudios se dedujo que el ATP y no la creatina proporcionan directamente la energía para la contracción muscular.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA

El método que sugerimos en esta práctica es una modificación y simplificación del método descrito por Louis Berger. El método original es el método propuesto por Lohmann, Shuster y Kerr. El ATP preferencialmente se obtiene del músculo de conejo. El conejo se anestesia con sulfato de magnesio al 51%. Luego se sacrifica al animal y se separa todo el músculo posible. Entonces el ATP se extrae con ácido tricloroacético. Se sigue luego una serie de precipitaciones del ATP como sal de bario y de mercurio. La sal de mercurio se descompone con H2S y se vuelve a precipitar como sal de bario. Mientras mas precipitaciones se hagan mayor será la pureza del ATP que se obtiene. Después de cuatro precipitaciones se llega a obtener de 90 a 95 %  siendo la mayor impureza la sal da bario del ADP.

En condiciones óptimas se obtiene un rendimiento de 2 a 3 gramos de la sal de bario del ATP por cada kilogramo de músculo. Como de un conejo normal salen unos 500 gramos de músculo, nuestro rendimiento en la práctica debe de ser de 1 a 1.5 gramos de ATP.

Si se dispone de espectrofotómetro de ultravioleta se puede al final sacar el espectro de absorción para confirmar que es ATP. También se puede hacer la reacción de Bial, que debe de dar positiva por la presencia de la ribosa, siendo esto una confirmación de lo que se ha obtenido es ATP.

MATERIAL NECESARIO

Primera parte:

Jeringa de 5 o 10 ml.

Cuchillo filoso o bisturí

Tijeras o navaja

Lienzo para filtrar (pañuelo o tapaboca)

Cuba para hielo

Erlenmeyer Kitasato con manguera y embudo Buchner de 10 cm. de diámetro

3 vasos de precipitado de 500 ml.

4 matraces erlenmeyer de 500 ml

4 embudos de vidrio

1 balanza granataria

2 probetas de 100 ml

1 pipeta de 5 ml

1 pipeta de 10 ml

1 dosificador

Guantes de hule

Licuadora

Gran cantidad de Papel filtro

Hielo

Bomba para vacío

Segunda parte:

4 vasos de precipitado de 500 ml.

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