“Medidas De Crecimiento Microbiano (Turbidimetría; Escala De Mcfarland)”

Tecnólogo Químico

Microbiología I

“Medidas De Crecimiento Microbiano (Turbidimetría; Escala De Mcfarland)”

Sebastian Grasso
Cesar Olivera

Profesor/a: Mariana Perroud

2016[pic 1]

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Marco Teórico:

El crecimiento microbiano es el incremento ordenado de todos los constituyentes celulares que conduce a un aumento de masa y finalmente a un aumento del número de células. Como ya sabemos esto se logra con el aporte adecuado de nutrientes y de las condiciones necesarias del medio como ph, temperatura de incubación, etc.

Una vez efectuado el crecimiento de los m.o se suele proceder a realizar un conteo para estimar la cantidad de ufc presentes en una determinada muestra, para ello existen diferentes métodos los cuales se pueden diferenciar en dos grandes grupos, métodos de recuento directo, o métodos indirectos/cualitativos, donde se relaciona algún factor con el número de microorganismos.

En la siguiente práctica se empleará la medición del crecimiento mediante un  método turbidimétrico ya que resulta ser rápido y útil para la estimación del número de células.

Para ello es necesario saber que cuando una suspensión aparece turbia es debido a que las partículas dispersan la luz incidente. Cuantas más células haya, más luz se dispersa y más turbia aparece la solución. Esta turbidez generada por la presencia de células se puede medir con un fotómetro o espectrofotómetro (equipos que detectan la luz no dispersada por la muestra).

La diferencia entre un fotómetro y un espectrofotómetro  radica en la manera de hacer generar la luz, el primero emplea un filtro simple (rojo, verde o azul) para generar la luz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientras que el espectrofotómetro utiliza un prisma o red para generar luz incidente de una banda estrecha. Los resultados arrojados por este tipo de equipos se suelen obtener en unidades fotométrica (unidades Klett por ej.) o en unidades de densidad óptica (DO) para el espectrofotómetro.

Las medidas de turbidez generalmente son precisas, y tienen la ventaja de ser rápidas y fácil de realizar, para organismos unicelulares las unidades fotométricas son proporcionales (dentro de ciertos límites) a la masa celular, y también al número de células.

Sin embargo a elevadas concentraciones de células la luz dispersada puede ser captada por otra y cuando esto ocurre se pierde la linealidad entre el número de células y la turbidez. 

El patrón o la escala de McFarland que utilizaremos a lo largo de la practica consiste en una serie de tubos herméticamente cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la aparición de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (Cl2Ba) al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N).

Esta turbidez puede interpretarse ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de ellas se corresponde a una concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (cél/ml) que genera una turbidez similar. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así preparado puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1cm; para el estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08 a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser verificado por ajuste de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez, preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensión así ajustada puede tener un conteo de 1,5x108ufc/ml.

Objetivos:

• Preparar estándares para su utilización a nivel de laboratorio.
• Realizar comparaciones con cultivos inoculados con microorganismos.

Materiales:

• Matriz a analizar (carne, queso, etc.)
• Agua peptonada al 0,1 %
• Cloruro de bario al 1,175 %
• Ácido sulfúrico al 1 %
• Medio Plate Count Agar.
• Tubos con 5 ml. de agua peptonada al 0,1 %.
• Frascos con 90 ml. de agua peptonada al 0,1 %.
• Pipetas y placas.

PARTE A: preparación de los tubos de la escala de Mcfarland.

Se prepararon 10 tubos de la escala de Mcfarland según las siguientes proporciones:

PARTE B: preparación de la muestra y  siembra por método de vertido.

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