Practica 2 método de Sanger

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Introducción

La diversidad de funciones de las proteínas proviene de la interacción concertada de los aminoácidos. La secuencia de aminoácidos determina: su estructura, predecir la función de la proteína, clasificar las proteínas en familias, detectar secuencias de aminoácidos con funciones importantes (localización celular, interacciones, etc.) y conocer las reacciones genéticas y evolutivas.

Dado que la identidad de una proteína está determinada por su secuencia de aminoácidos, la obtención de esta ha resultado en un objetivo de evidente importancia. Los métodos experimentales que permiten lograrlo han estado en continua transformación desde los trabajos de Frederick Sanger en 1953 quien fue el primero en secuenciar una molécula biológica de gran tamaño (la insulina). El método para marcar y separar el amino-terminal del péptido sin perturbar los enlaces entre los otros residuos de aminoácidos, conocido como el método de degradación secuencial el cual continúa siendo utilizado abundantemente y ha permitido la derivación de secuencia de una gran cantidad de proteínas.

Objetivos

• Utilizar el método de Sanger para determinar el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina.

Procedimiento: 

1)Colocar 30 mg de la hemoglobina en un tubo con tapón de rosca, adicionar 2.4mL

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de bicarbonato de sodio al 4.2% y disolver la proteína.

2) Añadir 2 mL de la solución de DNFB al 1% (medir con propipeta) y agitar fuertemente la suspensión durante una hora, manteniendo el pH entre 8 y 9 con adición, si es necesario, de bicarbonato de sodio al 4.2

3) Al terminar la dinitrofenilación, ajustar el pH abajo de 3 con aproximadamente 12 gotas de HCl 3 N.

4)En el tubo, extraer 4 veces la suspensión con volúmenes iguales, aproximadamente de 5 mL de éter saturado con solución acuosa de FeSO4. Desechar los extractos etéreos en los recipientes designados para tal efecto.

5)Colocar el tubo que contiene la proteína dinitrofenilada en baño maría y agitar hasta evaporar los residuos de éter que pudieran haber quedado.

6)Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos. Eliminar el sobrenadante.

7) Añadir 5 mL de HCl 6 N. Marcar el tubo y calentar en autoclave 3 horas a 15 libras de presión.

8) Agregar al contenido del tubo 5 mL de H2O destilada. Realizar 3 lavados con 5 mL de éter cada vez y colocar las fases etéreas en un vaso de precipitado. Al finalizar, desechar la fase acuosa.

9) Calentar los extractos etéreos en una parrilla casi a sequedad, enfriar y disolver el residuo en 0.5 mL de acetona o alcohol absoluto.

10) Realizar la cromatografía en papel del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina.

Resultados

Fundamento del procedimiento:

La hemoglobina es nuestra proteína problema y de ella determinamos su amino terminal en la práctica; el NaHCO₃ al 4.2% disuelve la proteína y nos proporciona un medio alcalino; el DNFB al 1% reacción de dinitrofenilación del aminoácido N-terminal de la proteína, reaccionando con los grupos aminos de la hemoglobina; el HCl 3N nos ayuda a bajar el pH y al disminuirlo detiene la reacción y refuerza el enlace entre el DNFB y la proteína; el éter saturado con FeSO₄ nos sirve para disolver el exceso de DNFB que no haya reaccionado, el FeSO₄ elimina los peróxidos que se formen y evita que la solución explote;  de los 15 min/3000rpm obtenemos dos fases, la acuosa donde se encuentra la proteína y la etérea donde está el fluorodinitrobenceno; el baño maría evapora el exceso de éter en la solución; el HCl 6N, 121°C, 35 lb/in2, 3hr nos provee un medio ácido en el cual la proteína se hidroliza, rompiéndose los enlaces peptídicos, liberando los aminoácidos; la parrilla seca la muestra y la concentra; acetona nos facilita disolver el residuo; el ácido cítrico y citrato de sodio son los solventes de la cromatografía; la Cromatografía en papel realiza la separación e identificación de los aminoácidos.

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