Preparacion De Frotis

3.1.4 Preparaciones en fresco

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose efectuar el diagnóstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.

3.1.5 Tinciones

El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movímiento de los microorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas Poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

TABLA 3.2 Técnicas de tinción para bacterias

Tinción Uso Técnicas

Tinciones simples Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.

Tínciones diferenciales

Tinción de Gram Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen) Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.

Tinciones especificas

Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.

Tinción de flagelos de Leifson Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.

Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que se observa como una región clara alrededor de la célula.

En microbiología el termino a fresco se refiere a preparaciones o suspensiones de una muestra en agua u otro liquido que se colocan entre porta y cubreobjetos.Este tipo de preparaciones constituye el método mas simple y rápido para determinar movilidad de microorganismos.en el caso de bacterias , se coloca una gota de cultivo liquido de menos de 18 horas de incubación entre una lamina portaobjetos y

...