Taller de extracción de DNA.

Universidad de Panamá

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina

Departamento de Biología Celular y Molecular

Laboratorio de Biología # 4

“Extracción de DNA de Tejido Animal”

Profesora: Maribel A. González T.

Integrantes:

Isabella Riquieri

Céd. EC-42-11650

Olga Candanedo

Céd. 4-783-2146

Luis Pretto

Céd. 8-912-2428

Grupo 2.1a

Fecha:

28 de septiembre de 2015

INTRODUCCIÓN

El DNA (Deoxyribonucleic acid), la molécula de la vida, tiene como unidad básica el nucleótido; a su vez, este está constituido por un azúcar de cinco carbonos (la desoxirribosa) que está fijada a un fosfato esterificado y una base nitrogenada. Existen dos tipos de bases nitrogenadas, las pirimidinas (que contienen solo un anillo y existen dos: la timina y la citosina) y las purinas (poseen dos anillos y existen dos: guanina y adenina). Los nucleótidos están unidos de forma covalente para formar un polímero, una cadena, la cual está unida a una cadena complementaria por medio de puentes de hidrogeno. Además, es importante resaltar que las bases nitrógenos están unidas entre sí en un orden específico, la adenina se une con la timina, mientras que la guanina se une a la citosina. Es importante recordar que el DNA se encuentra en los núcleos y está contenido también en los cromosomas y plastidios como cloroplastos y mitocondria.

El DNA no existe de forma libre dentro de las células, sino que está asociado con proteínas y RNA. De ahí la importancia de la extracción de DNA, se hace para separarlo y poder así, realizar otros procedimientos de laboratorio en biotecnología y/o biología molecular. La primera vez que el DNA fue aislado fue en 1866 por Friedrich Miescher, quien comprendió que el DNA era muy diferente de todos los otros compuestos conocidos en la época.

Ciertos procedimientos, como: lisis celular, inactivación de las nucleasas y separación de estos del debris celular, son requeridos para el aislamiento de los ácidos nucleicos. La lisis celular incluye: la disrupción mecánica (consiste en la trituración, por ejemplo, el hígado con la ayuda de arena), el tratamiento químico (agregar detergente) y digestión enzimática (Proteinasa K).

El detergente es muy importante en este procedimiento porque tiene la capacidad de disolver los lípidos y proteínas de la célula, rompiendo los enlaces débiles que los mantiene unidos a la membrana celular. Además, puede contribuir para la precipitación de los lípidos y proteínas y en la inhibición de las nucleasas presentes en la preparación. Normalmente se utiliza el SDS, o dodecilsulfato sódico, como el detergente, pero en la ausencia de este, se podría utilizar uno común.

La combinación de fenol-cloroformo en altas concentraciones de sal es muy utilizada para la eliminación de contaminantes del DNA, y es un paso importante del procedimiento para garantizar una mejor muestra de DNA. El debris celular puede ser removido a través de la centrifugación. A la preparación es necesario agregar el cloruro sódico 2M (NaCl) para generar un medio más concentrado con soluto y así, mediante difusión, hacer con que la célula explote dejando el DNA libre. El DNA es precipitado usualmente con isopropanol o etanol frío, ya que el DNA no es soluble en este y así podrá flotar y permitir que sea visto fácilmente – si se usa alcohol a temperatura ambiente o caliente, el DNA también se disolverá imposibilitando su separación y visualización.

La extracción de DNA es un procedimiento simples, pero que se necesita mucho cuidado y atención para que la muestra de DNA este en buenas condiciones (confiable, limpio y de calidad) para el procedimiento que se realizará después utilizándolo. Tal procedimiento es casero pero en laboratorio, es realizado con ciertos aparatos que permiten una extracción más precisa. Este aislamiento precede procedimientos como: los estudios de paternidad, trabajos forenses, amplificación mediante la PCR de secuencias específicas para su análisis, estudios taxonómicos, estudios evolutivos, y otros.

OBJETIVO GENERAL

• Conocer los diferentes pasos que conllevan la extracción y/o aislamiento del DNA del tejido animal.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Utilizar técnicas básicas para poder extraer el DNA de un tejido animal.
• Confirmar visualmente la estructura fibrilar y la presencia de DNA.
• Comprender cuál es la función de los diferentes reactivos que se utilizan durante la extracción del DNA.

METODOLOGÍA

1. Trituramos medio hígado de pollo en un mortero. Añadimos arena para que al triturar se pudiera romper las membranas de las células y quedaran los núcleos sueltos.

1. Añadimos al triturado 50mL de agua y mezclamos hasta que se hiciera una papilla.

1. Filtramos varias veces sobre el filtro de café para separar los restos de tejidos que quedaron por romper y también para separar la arena de la papilla.

1. Medimos el volumen del filtrado con una probeta.

1. Añadimos al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M para producir la lisis de los núcleos y liberar las fibras de cromatina.

1. Añadimos 1mL de SDS 10%.

1. Añadimos mediante una pipeta 50mL de alcohol frío al 95%, de modo tal que se deslizó por las paredes del vaso.

1. Introducimos un palillo de diente que fue girado en la misma dirección, donde se adhirió fibras blancas que es la agrupación de muchas fibras de DNA.

1. Tomamos la muestra de DNA y depositamos sobre un portaobjeto.

1. Teñimos la muestra con azul de metileno.

1. Observamos la muestra en el microscopio.

RESULTADOS

Observaciones hechas del DNA de hígado de pollo.

[pic 1]

[pic 2]

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DISCUSIÓN

1.  ¿Cómo el detergente produce la lisis de las células?

Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los detergentes, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies hidrofóbicas. Al romperse las membranas celulares se permite la salida del DNA.

1. ¿Cuál es la función del NaCl en la extracción del DNA?

Formar una capa iónica suave que recubre al DNA protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; permite a los ácidos nucleicos ser precipitados de una solución de alcohol.

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