Extraccion DNA cromosomal.

EXTRACCION DEL DNA CROMOSOMAL

1. OBJETIVOS

• Presentar al estudiante los conceptos básicos de bioseguridad y las normas generales que deben aplicarse para trabajar en laboratorio de biología molecular.
• Describir e identificar materiales y procedimientos utilizados para la toma y manipulación de muestras biológicas.
• Extraer ADN cromosomal de leucocitos (sangre).
• Entender el concepto de DNA cromosomal y su aplicación en laboratorio.
• Determinar algunas de sus características físicas.

1. MARCO TEORICO

El material genético DNA representa la información hereditaria y está contenido en estructuras conocidas como cromosomas, las células contienen cromosomas que se duplican antes de la división celular. En esta práctica se analiza como extraer el material genético para posteriores estudios como su caracterización, diagnostico, clonación, determinación de paternidad, diagnóstico de enfermedades y los trastornos genéticos, etc.

El DNA está presente en los indicios biológicos como sangre, semen, saliva, tejido, hueso, pelo, etc.

Extracción DNA en la sangre se destruye membranas nucleares, se liberan ácidos nucleicos para luego extraerlo con cloroformo y la precipitación del DNA con etanol al 70%.

CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

La concentración del DNA de eucariontes y procariontes depende de la purificación del DNA.

La extracción del DNA total de bacterias se realiza generalmente utilizando sustancias quelantes como el EDTA que produce lisis e inactiva las Dnasas.  El DNA obtenido contiene una mezcla de moléculas orgánicas que deben ser eliminadas, por ejemplo, las proteínas que son digeridas por la proteinasa k, el RNA se elimina con ribonucleasas y finalmente el DNA se purifica por precipitación con etanol absoluto.

Los plásmidos mantienen su forma circular, por tanto, el superenrollamiento.  La forma más habitual de su purificación consiste en una centrifugación con cloruro de cesio y en presencia de bromuro de etidio para disminuir su densidad y separar por gradiente del DNA lineal.

El material genético extraído se puede cuantificar por espectrofotometría y electroforesis, aplicando la técnica espectrofotométrica el material genético (DNA y RNA) absorben la radiación electromagnética a una longitud de onda de 260 nm, por medio de este método, se determina concentraciones de 2,5 microgramos por mililitro. 

Una desventaja de la espectroscopia es que no diferencia las clases de ácidos nucleicos DNA y RNA, ni los nucleótidos sueltos, por esta razón es prescindible que el DNA sea de alta pureza.

AISLAMIENTO DE LINFOSITOS

Permite aislar las células mononucleares para realizar diferentes técnicas inmunológicas de inmunidad celular, así como obtener los polimorfonucleares para realizar la función fagocitica y extraer el DNA nuclear para análisis de enfermedades genéticas o identificar a los individuos mediante la huella genética.

Reactivos para la extracción del DNA cromosomal

• Citrato de sodio o ácido citrato dextrosa, se utiliza para interrumpir la cascada de coagulación y prevenir la coagulación. Estos compuestos de citrato se enlazan con el calcio en la sangre. Al reducir la cantidad de calcio, no habrá ninguna regulación del enlace y la coagulacion no podrá comenzar.
  
  El citrato suele omitirse, ya que muchos médicos son más propensos a usar EDTA, o ácido etilendiaminotetraacético, ya que tiende a enlazar el calcio de manera más fuerte e irreversible. Estos anticoagulantes se utilizan en tubos de ensayo, equipos médicos y quirúrgicos e instrumentos de laboratorio con el fin de mantener la sangre coagulada evitando que se vuelva inutilizable para fines médicos. 
• EDTA: anticoagulante (inhibe los factores de coagulación con el Calcio-EDTA complejo). Inhibe la acción de las enzimas.
• Solución I: es una solución de lavado (limpia las proteínas de los leucocitos y disuelve los lípidos). Lisis de glóbulos rojos.
• Solución de lisis: también es de lavado y una solución amortiguadora (liga los glóbulos blancos y libera DNA para ser extraído). Lisis de glóbulos blancos.. si fuera bacteria solo rompe pared celular.
• Ficoll 20%: Separar globulos rojos de blancos.
• Lauril sulfato sódico (SDS): separa lípidos de proteínas. Detergente fuertemente iónico que desnaturaliza las proteínas, rompe la membrana celular y la pared celular de cualquier célula. (debilita la membrana de la célula e interactúa con los lípidos y forma esteres).
• NaCl: liga y destruye  la membrana de las células a trayendo los iones que contienen DNA.
• Raspado de hielo: o baño de hielo, este inactiva las enzimas (DNAasas, RNAasas, exonucleasas, endonucleasas).
• Rtvo de cloroformo, fenol y alcohol isoamilico: utilizado en extracción liquido-liquido del DNA.
• Cloroformo: disuelve compuestos orgánicos. Solubiliza los lípidos.
• Fenol: desnaturaliza proteínas solubles.
• Alcohol isoamilico: Aumenta la polaridad. solubiliza proteínas.
• H2O: Disolvente que tiene afinidad con el material genético por la polaridad que tienen ambos.
• Etanol Absoluto: Precipita el DNA.

• Acetato de sodio (CH3COONa): Estabiliza la cadena del DNA porque actúa a nivel de las histonas y ayuda a que precipite las proteínas (se producen a menor temperatura y a un pH acido la precipitación de las proteínas y cuando sucede eso ya no son solubles ni en medio orgánico e inorgánico).
• Etanol 70%: purifica el DNA ya que lava las sales que hayan quedado adherido al DNA.
• Solución de Resuspensión: Resuspende y disuelve el DNA.
• Bromuro Etidio: identifica el DNA por fluorescencia en lámpara de U.V. Este colorante se fija al DNA de manera irreversible modificando los genes de este DNA. (provoca mutación genética)

1. DESARROLLO DE LA PRACTICA

Modificación de la técnica de extracción

• Extraer 5 ml de sangre con anticoagulante 3 gotas de citrato de sodio 10 gotas de EDTA 10%
• Centrifugar 5 minutos a 2500 rpm dejar 0,5 cm de altura de plasma, el resto se desecha.
• Añadir  200 uL de solución I
• Colocar la muestra sobre 1 mL de ficoll al 20 %
• Agitar ½ de inmersión
• Centrifugar a 2500 rpm por 15 minutos
• Se colecta el anillo de células mononucleares
• Agregar 200 microlitros de la solución de lisis. 
• Agregar  300 microlitros de SDS al 20 %
• Agitar vigorosamente para romper la pared celular y membrana celular
• Agregar 200 microlitros de cloruro de sodio (M) preparado por cada subgrupo del laboratorio
• Incubar a 4 grados centígrados, hasta la siguiente clase (esto se le llama raspado de hielo).

Todos los pasos deberán de realizarse en raspado de hielo

• Extraer el DNA con una mezcla de cloroformo, fenol y alcohol isoamilico, 500 microlitros.
• Centrifugar 5 minutos a 10 000 rpm
• Colectar las soluciones polares
• Añadir a la fase clorofórmica 400 microlitros de agua y 200 microlitros del reactivo cloroformo, fenol y alcohol isoamilico.
• Centrifugar 5 minutos a 10 000 rpm
• Colectar las soluciones polares
• A las soluciones polares añadir dos volúmenes de etanol absoluto y 100 microlitros de acetato de sodio (M) preparado por cada subgrupo del laboratorio. Incubar a 0°C
  o -55°C.
• Centrifugar a 10 000 rpm por 3 minutos descartar el sobrenadante
• Agregar 500 microlitros de etanol diluido, preparada por cada subgrupo del laboratorio, centrifugar a 10 000 rpm por 3 minutos. 
• Descartar el sobrenadante y dejar secar el residuo.

• Resuspender con 20 microlitros de la solución de resuspensión
• Añadir  el reactivo  bromuro de etidio  7 microlitros.
• Observar el  DNA  a 312 nm en el transluminador.

      4.    OBSERVACION

Al tener la sangre en el tubo de ensayo, después de someterlo a una centrifugación para separar los leucocitos, rompiéndolos y quedando suspendidos en la parte de abajo del tubo contenido de estos (DNA y otros residuos celulares ajenos, etcétera), prosiguiéndose a seguir limpiando el DNA sometiéndose a varios ciclos de centrifugación para obtener una suspensión blanquecina (botón blanco) en el tubo con la solución. Una vez obtenido este DNA, se prosiguió finalmente a deshidratarse según lo indica el procedimiento indicado, obteniéndose después el botón blanco suspendido en agua destilada, el cual quedó en el refrigerador para su posterior uso.

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