Transformación

Método de Biuret

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre. El complejo presenta un color violeta característico que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno.

En solución alcalina, el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina.

El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre, o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxigeno y de nitrógeno del péptido.

Después de la adición del reactivo de cobre, se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. (Nollet, 1996)

Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)

Las características más importantes de la reacción son:

I.- Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.

II.- No depende de la composición de aminoácidos.

III.- Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

IV.- El espectrofotómetro que se maneja es del tipo convencional de haz simple.

Ejemplo: Utilizando como muestra suero o plasma sanguíneo (heparina o EDTA). Se separa el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3 horas. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor.

Método de Kjeldahl

En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto los compuestos no proteicos como las proteínas verdaderas. (Nollet, 1996)

El método se basa en la determinación de la cantidad de nitrógeno orgánico contenido en productos alimentarios, que compromete dos pasos consecutivos:

I.- La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido sulfúrico concentrado.

II.- El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra.

Durante el proceso de descomposición, ocurre la deshidratación y carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio.

La recuperación del nitrógeno y la velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la adición de un catalizador. (Nollet, 1996)

El método de Kjeldahl consta de las siguientes etapas:

1. - Digestión: Proteína + H2SO4 → CO2+ (NH4)2SO4 + SO2

2. - Destilación: (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + NH3↑ + H2O

3. - Titulación: NH4Cl + HCl + NaOH → NH4Cl + NaCl + H2O

En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el destilado se retiene y se valora por retroceso. El método Kjeldahl no determina todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993)

Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno.

Ejemplo: Es altamente utilizado en los factores de conversión de nitrógeno a proteína para algunos alimentos.

Método de absorción en el Ultravioleta a 280nm

La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptófano. Se fundamenta por este tipo de anillos aromáticos.

La cuantificación de proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación. En este método se toma en cuenta la absorción del disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimidina.

Al finalizar se realiza una comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Nollet, 1996)

Ejemplo: Las disoluciones acuosas de Cu2+ Cu (H2O) 42+ son de color azul pálido, mientras que las que no cumplen con estas características, no presentan esta coloración.

Método de Lowry

El método de Lowry combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfo-molíbdico y fosfo-túngstico) por la oxidación de la tirosina, triptófano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas. (Nielsen, 1988)

• Reacción de Folin-Ciocalteu: Característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin generando un color azul.

El proceso de oxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul característico. Los quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido. Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una disolución. El desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996)

Ejemplo: A pesar de que está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.

Método Turbidimétrico

La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico

...