La Gran Cromatográfia en capa fina.

Práctica 1º: Separación de pigmentos vegetales por cromatografía sobre papel

1. Objetivo

Separar distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

1. Fundamento teórico

Los cloroplastos deben su color verde a un pigmento denominado clorofila. Sin embargo, lo que en realidad existe en los cloroplastos es una mezcla de pigmentos representados principalmente por dos tipos de clorofila (clorofila a y clorofila b), por β-caroteno y por xantofila.

Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad, lo cual permite su separación cuando una solución de la misma asciende por capilaridad por una tira de papel de cromatografía, ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, ahora bien dependerá de la diferente polaridad del disolvente, pues acompañarán más o menos fácilmente al disolvente a medida que éste va ascendiendo.

De esta forma, al cabo de cierto tiempo, a lo largo del papel de filtro se irán situando los distintos pigmentos en forma de bandas coloreadas, tanto más desplazadas cuanto más solubles sean los pigmentos a que pertenecen y tanto más anchas cuanto mayor sea la abundancia de estos en la mezcla.

Se llevará a cabo una cromatografía en papel por el método ascendente a partir del extracto obtenido de las hojas verdes de una planta después de haber llevado a cabo una maceración con un disolvente adecuado.

1. Procedimiento experimental        

        3.1- Material y Equipos

• Papel Whatmman nº 1
• Mortero y mano de mortero de vidrio
• Varillas de vidrio
• Embudo de vidrio
• Soporte
• Aro metálico
• Pinza
• Papel de filtro
• Probeta 100 ml
• Probeta 50 ml
• Papel de aluminio
• Balanza Gram Serie SV Máx. 3100g d= 0,001g
• Puntas de micropipeta
• Placa Petri
• 3 Vasos de precipitados 50 ml
• 2 Vasos de precipitados 250 ml
• Vaso de precipitados 1000 ml
• Vaso de precipitados 500 ml
• Vaso de precipitados 100 ml

        3.2- Reactivos utilizados

• Acetona Pura (CH3COCH3, P.M.= 58,08 g/mol)  [Deliplus]

• Nº CAS: 67 – 64 – 1
• Precauciones:

• Inflamable
• Irritante ocular

• Etanol (96% ,CH3CH2OH, P.M.= 46,07 g/mol)[Cidas]

• Nº CAS: 64 – 17 – 5
• Precauciones:

• Inflamable
• Irritante ocular

• Hexano, mezcla de alcanos (95%, C6H14, P.M.= 86,16 g/mol)

• Nº CAS: 110 - 54 – 3
• Precauciones:

• Inflamable
• Explosivo
• Irritante

• Carbonato cálcico (CaCO3, P.M.= 100,087 g/mol)

• Nº CAS: 471 – 34 – 1
• Precauciones:

• Irritante

        3.3- Muestra a analizar

Espinacas frescas

        3.4 - Procedimiento a seguir

1. Lavar bien las hojas de espinacas con agua.
2. Secar bien las hojas.
3. Eliminar las nervaduras y cortar las hojas en trozos pequeños.
4. Pesar aproximadamente 10g – 12g de muestra.
5. Dividir la muestra en cuatro partes.
6. Medir 80 ml de acetona y 20 ml de etanol en una probeta de 100 y 50 ml respectivamente.
7. Mezclar en un vaso de precipitados de 100 ml.
8. Introducir la cuarta parte de las hojas en un mortero de vidrio junto a un trozo de tiza.
9. Añadir unos 25 ml de acetona-etanol.
10. Molturar bien la muestra hasta que el extracto tome un color verde oscuro.
11. Realizar un filtro de pliegues.
12. Preparar el soporte con el aro metálico, el embudo y el papel de filtro.
13. Filtrar la muestra en un vaso de precipitados de 500 ml.
14. Repetir tres veces mas la extracción, hasta obtener unos 75 ml de extracto.
15. Realizar tres tipos de eluyentes con concentraciones diferentes.
16. Medir hexano según concentración elegida en una probeta de 50 ml en la campana de seguridad.
17. Medir alcohol según concentración elegida en una probeta de 50 ml.
18. Mezclar alcohol – hexano en un vaso de precipitados de 50 ml.
19. Tomar un trozo de papel Whatmman nº 1.
20. Colocar tres gotas de extracto en el papel utilizando una punta de micropipeta.
21. Encima del extracto añadir las gotas de los diferentes concentraciones de los eluyentes, con la ayuda de las puntas de micropipeta. Encima de cada gota de extracto poner una gota de las diferentes concentraciones .
22. Elegir los dos eluyentes que produzcan una mejor separación de los pigmentos.
23. Poner en la placa Petri unos 10 ml de extracto y una tiza en forma vertical. Tapar con un vaso de precipitados de 1000 ml.
24. Poner un volumen de 50 ml de eluyente en un vaso de precipitados de 250 ml para la cromatografía. Poner cada eluyente elegido en dos vasos de precipitados diferentes.
25. Preparar dos tiras de papel de cromatografía de 12 cm de largo y 2 cm de ancho.
26. Pintar en cada tira una línea de 1cm en el extremo inferior y aplicar el extracto en el centro de la línea. Aplicar la muestra un mínimo de tres veces.
27. Unir cada tira a una varilla de vidrio.
28. Poner cada tira en los vasos de precipitados sin que toquen la pared y tapar con papel de aluminio.
29. Esperar a que el frente del solvente suba por el papel arrastrando los pigmentos.
30. Cuando se vean los pigmentos bien separados sacar el papel del vaso de precipitados y dejar secar.

1. Observaciones y conclusiones

        5.1- Observaciones

        Utilizamos las concentraciones Hex/Alc 1:2 y Hex/Alc 1:3 porque se         apreciaba mejor la separación de los componentes como se ve en la         fotografía.

        El extracto después de unas dos horas subió hasta la mitad de la tiza.

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