Medios de Cultivo de Protozoos.

Protistas

Práctica 3: Medios de Cultivo de Protozoos de Vida Libre

Mtra. Paloma Susan Tepetlan

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José Rodrigo Carral Domínguez

Sección 4

• Introducción:

La necesidad de cultivar microorganismos para su estudio se hizo patente desde los inicios de la Microbiologia. Hoy en día, la dificultad de estudiar los microorganismos en su hábitat presenta muchas dificultades. Tal necesidad se conoce desde los primeros microbiólogos. Robert Koch, descubridor del Bacilo de la Tuberculosis, utilizaba rebanadas de papa y gelatina como solidificante para hacer los primeros cultivos microbiológicos. Su colaborador, Walter Hesse, introdujo una técnica esencial hasta hoy en día, el uso del Agar, un polisacárido derivado de las algas rojas, como medio solidificante para los cultivos. En 1887, Richard Petri introduce el uso de las cajas Petri, también de uso común en la Microbiología. (Brock, 2009)

 Todos ellos reconocieron problemas esenciales en la Microbiología: la necesidad de cultivar artificialmente un medio ambiente apto para mantener vivos y en buenas condiciones en el laboratorio. A esto le llamamos un medio de cultivo, y tiene múltiples factores esenciales que el Microbiólogo no debe perder de vista si quiere al menos, tener la oportunidad de estudiar microorganismos.

Los medios de cultivo, son aquellos sustratos que favorecen el crecimiento y reproducción de los organismos, agua más sales más materia orgánica, que sea factible de descomponerse y generar alimento para otros organismos (bacterias y nutrientes). Hay medios que pueden adquirirse en empresas especializadas para protozoos de vida libre, parásitos y organismos asociados (Needham, 1959).

Todo el material a utilizar debe estar limpio, evitar trazas de sustancia químicas, jabón u otras sustancias que puedan ser toxicas para los protozoos; algunos medios es recomendable esterilizarlos antes de hacer algún inóculo. (Castañeda, 2009)

 Generalmente se precisa guardar una muestra de los sitios de muestreo para ser cultivados, la mejor opción, es que se ponga una cantidad del agua original -en un frasco chico o caja de Petri, llenada 3⁄4 partes de su capacidad- y agrega un grano de trigo o de arroz o materiales (hojas, un poco de tierra, piedrecillas) del lugar de colecta. Las especies crecerán y muy seguramente serán reemplazadas en un lapso corto de tiempo por otras; de ahí que si se pretende observar a los organismos originales de ese tiempo y lugar, debe hacerse la observación en un lapso no mayor de 48 horas. Se debe procurar no poner demasiado alimento; si el agua se evapora, agregar un poco de agua bidestilada (el agua de la llave es un veneno para muchos organismos). Colocar los cultivos en el laboratorio de manera que no les de la luz directa del sol. (Cortés, 2010)

Algunos protozoos reaccionan bien a los cultivos, otros mueren o se ven disminuidos en número; así mismo, cambios repentinos de temperatura, de oxígeno, o bien, movimiento excesivo causa alteraciones en ellos. Las cajas de Petri de 7 mm, son una excelente opción para conservarlos en espacios pequeños – ya que se pueden apilar- , ventilados y frescos, siempre llenados a 3⁄4 partes de su capacidad para permitir que respiren. Algunas combinaciones que han funcionado son (Sánchez, 1994):

AMIBAS.- 1 a 2 granos de trigo por cajita o mezcla de trigo y avena, 2 o 3 granos de arroz. FLAGELADOS.- 1 a 2 granos de arroz por cajita (de petri de 7 mm), una pizca de Quick de vainilla (saborizante de leche Nestlé ®), o una pizca de leche en polvo. Para los autótrofos, luz artificial es adecuado.

CILIADOS.- 1 a 2 granos de trigo, paja, Quick de fresa (saborizante de leche Nestlé ®).

Hacer subcultivos mejora la calidad de los organismos, con máximos de poblaciones. Considerar luz moderada que no le de la luz del sol, pH de neutros a ligeramente alcalinos, temperaturas de 20 a 22o C, dado que los organismos son muy susceptibles. Quitar los granos de trigo o arroz en descomposición, limpiar los bordes de lo contenedores y agregar o medio de cultivo Chlakley (Kudo, 1982) – ver  o agua destilada o agua del sitio de muestreo limpia). Los cultivos pueden ser: Mixtos: contienen una gran riqueza de especies.

Axénico: Es aquel donde se desarrolla una sola especie, sin ningún otro organismo; puede mantenerse si se impide la acumulación de toxinas y se subcultiva periódicamente. Monoaxénico: Una sola especie es mantenida con otras especies (generalmente bacterias) como alimento. Infusiones: agua hervida previamente y fría, destilada; hervida con un nutriente (trigo, arroz, alfalfa, lechuga seca, cereales, paja, leche en polvo, chícharo o pasto seco, musgo, hojarasca) y dejar reposar 24 h para posteriormente hacer el inóculo. Evitar el crecimiento bacteriano excesivo. Colocares en envases de boca ancha y ligeramente tapados o ponerles un pedazo de papel celofán que permita el intercambio gaseoso pero no la entrada de polvo excesivo (López y Serrano, 1997).

Existen en bibliografía una gran variedad de medios de cultivo para permitir el crecimiento de organismos en general o para organismos muy específicos (Foissner, 1992; Lee et al., 2000)

El medio Chalkley, funciona muy bien, usar agua destilada o pasteurizada con granos de trigo o arroz según sean los organismos a cultivar (ciliados y flagelados en el primer caso y el arroz para las amibas, como se mencionó anteriormente), se esterilizan a 15o C por 15 minutos, o bien hervirlos por un tiempo igual; una vez fríos, se pueden inocular los organismos de preferencia en una campana de extracción o cerca de un mechero para evitar la contaminación por otros organismos. Se recomienda también dejar estabilizar el medio nuevo. Para una mejor observación, conviene dejarlos sedimentar por 5 a 10 minutos y proporcionarles el alimento adecuado. Observarlos con el microscopio para seguir su crecimiento. Por ejemplo, los paramecios se congregaran alrededor de la comida, las vorticelas y las amibas, estarán adheridas a un sustrato en el fondo o bien en la superficie, Coleps, Cyclidium serán especies muy abundantes; también algunos Stentor se podrán encontrar en las partes menos iluminadas de la cajita y fijos al fondo de ésta, los flagelados estarán nadando activamente, por lo que sin mover mucho el recipiente donde se tenga el cultivo se debe verificar las diferentes profundidades de éste. Se pueden alargar las puntas de las pipetas Pasteur –con un mechero- para tratar de “pescar” a los organismos para inocularlos y en un momento dado hacer cultivos monoaxénicos. Para protozoos enquistados: Hervir paja en agua destilada o pasteurizada por 5 a 10 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente, añadir un cantidad pequeña de la muestra y después de 24 horas observar el crecimiento. Los protozoos del suelo y alrededor de las plantas (perifiton) se recogen con un sifón o una pipeta gigante con una perilla de goma (algunas veces las jeringas de cocina funcionan excelentemente), una pipeta graduada de 25 o 50 mL de capacidad. Un aparato para enemas –comprado en la farmacia- funciona tapando el orificio más grande. Se pueden dejar sustratos artificiales susceptibles de ser colonizados (Cairns, 1982).

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