Actividad Enzimática en procesos de transformación

Laboratorio Bioquímica 2021-2[pic 1] 

Actividad Enzimática en procesos de transformación

Yulianna Chavarrío 1 y Natalia Lombana 2 

        1 Facultad de ingeniería, Universidad de la Sabana; mariachba@unisabana.edu.co 

        2 Facultad de ingeniería, Universidad de la Sabana; natalialogo@unisabana.edu.co 

        Recibido: Septiembre 15 de 2021

Abstract – The main objective of the experimental development was to measure the reaction rate of acid phosphatase extracted from wheat germ under different conditions, as well as the estimation of the kinetic parameters Km and Vmax from the experimental data with and without inhibition, identifying the experimental factors that are critical for the estimation of the kinetic parameters of the enzyme. The practice consisted of different stages divided into the extraction of acid phosphatase by means of a simple decantation process of a wheat germ solution, then a calibration curve of inorganic phosphate was made, followed by a procedure to determine the amount of phosphate produced by the action of acid phosphatase. Finally, five trials were carried out in which different parameters and conditions were varied to measure the effect of these on the reaction rate.

Key Words: Enzyme, substrate, rate of reaction, concentration, temperature, pH.

1. Introducción

En el mundo de la bioquímica ocurren una gran variedad de reacciones a nivel biológico, en donde intervienen un sinfín de componentes que permiten obtener distintos productos o rutas metabólicas. Dentro de estas reacciones y rama de la bioquímica aparece el concepto denominado como cinética enzimática, el cual corresponde a el estudio de la velocidad de las reacciones que están catalizadas por enzimas; Estas últimas son moléculas que como se menciona, actúan acelerando reacciones netamente biológicas y por lo general son de naturaleza proteica. (González, s,f.).

Debido a que las enzimas son componentes de carácter proteico, pueden desnaturalizarse tal como las proteínas y perder sus capacidades, es por esto que existen varios factores que pueden alterar su desempeño dentro de una reacción, dentro de estos factores se encuentra la temperatura, la concentración del sustrato (reactivo involucrado en la reacción), el pH o la presencia de inhibidores, los cuales son componentes que buscan disminuir la velocidad de una reacción química y se pueden tener condiciones óptimas pero estas dependen de el tipo de enzima estudiada. (Barman, 1985).

Profundizando un poco más en el campo de la cinética enzimática, se tienen diferentes ecuaciones que ayudan a describir el comportamiento de las reacciones biológicas que ocurren constantemente, dentro las cuales la más importantes es la ecuación de Michaelis-Menten que describe la velocidad de muchas reacciones enzimáticas, atribuida a dos bioquímicos muy importantes.

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Figura 1. Ecuación de Michaelis-Menten

Esta ecuación describe el cambio de la velocidad de una reacción catalizada por una encima y depende en gran cantidad de la concentración de sustrato presente y producto de esta ecuación se determinó la constante de Michaelis-Menten (Km) la cual describe la afinidad de una enzima con el sustrato, lo cual en otras palabras se puede establecer como la constante de disociación aparente entre la enzima y el sustrato. (López & García, 2015). En esta ecuación (1) se demuestra que un aumento en la concentración del sustrato repercute directamente en la velocidad de reacción aumentándola hasta un punto en el que la enzima se satura y se alcanza lo conocido como velocidad máxima de la reacción (Vmax). En adición a lo anterior, la cinética descrita por Michaelis-Menten se puede complementar con la linealización de Lineweaver-Burk, la cual funciona para calcular los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten y se basa en el recíproco o la inversa de esta cinética, es decir de la velocidad y la concentración de sustrato. (Lira & Jasso, 2013).

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Figura 2. Ecuación de Lineweaver-Burk

Con esta ecuación se puede establecer los valores de Km y Vmáx, obteniendo una recta donde el intercepto con el eje “y” es la inversa de la Vmáx y la pendiente de esta recta es Km/Vmax, con la ecuación de esta gráfica se pueden despejar estos valores para hallarlos.

Dentro de esta práctica de laboratorio que tiene como objetivo estudiar la cinética enzimática se trabajó la enzima fosfatasa ácida extraída del germen de trigo. Estas enzimas son un grupo amplio en la naturaleza con una especificidad amplia. Todas tienen una característica en común y es que actúan sobre monoésteres de ácido ortofosfórico (Jiménez, 1997) y la reacción que catalizan es la siguiente:

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La técnica a utilizar para la cuantificación de fosfato liberado es el método de Fiske-Subbarow que es un método colorimétrico basado en la reacción de fosfato con ácido molíbdico. Por último, se estudiará el efecto de diferentes factores sobre la velocidad de reacción, como lo es la concentración de sustrato, de la enzima, el pH, la temperatura, y la presencia de in inhibidor, para entonces calcular los valores óptimos de estas condiciones para la enzima fosfatasa ácida. Para estos procedimientos se utilizó como materia prima principal el germen de trigo, de donde se extrajo la enzima. Utilizando la ecuación del porcentaje de error (3) para determinar que tan distante fueron los datos obtenidos experimentalmente de lo esperado teóricamente

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1. Metodología

El desarrollo de esta practica comenzó por la extracción de la fosfatasa acida presente en el germen de trigo, para esto se  pesaron  10 gramos de germen de trigo junto a 50 ml de agua fría, esta mezcla fue agitada hasta que obtener una suspensión uniforme, que fue dejada en reposo por 30 min, y posteriormente fue decantada por 15 min, finalmente se filtro el sobrenadante a través de algodón y los residuos fueron descartados. Esta solución  es el extracto crudo de fosfatasa ácida, este estrato tuvo que ser conservado en hielo.

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