Actividad catalitica de la amilasa salival

Escuela de Química                                                                                                              Facultad de Ciencias                                                                                                                             Sede Medellín [pic 1][pic 2][pic 3]

Laboratorio de Bioquímica                                                                 Evaluación del potencial de hidrólisis de la α-amilasa salival bajo cambios de pH, temperatura y concentración.

Yisela Melid Batista; María del Mar Valencia

Estudiantes de ingeniería biológica

2020

[pic 4]

Resumen

La catálisis enzimática puede ser afectada por distintas variables como la temperatura, concentración, presencia de inhibidores, etc. Es por ello que se hizo una evaluación del potencial que tiene la enzima amilasa salival para catalizar la reacción de hidrolisis en el almidón al variar las condiciones de temperatura, acidez y concentración de forma independiente, pudiendo así analizar en qué medida llegan a afectar dichos parámetros la actividad de la enzima. Para efectuar tal evaluación se prepararon soluciones de distintas concentraciones de amilasa salival que luego reaccionan con una solución de almidón, además se sometió a diversos ambientes de acidez y temperatura la reacción entre la enzima y sustrato mencionados anteriormente, finalmente mediante técnicas de fotocolorimetría se midió de forma indirecta la presencia de sustrato. Gracias a el análisis realizado se pudo determinar cuáles son las mejores condiciones en las que la enzima trabaja eficazmente, las cuales tienden a ser aquellas similares a condiciones fisiológicas.

Palabras clave

• Almidón
• Actividad catalítica
• Enzima

Introducción

Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya función es catalizar reacciones químicas, realizando un cambio químico en el sustrato sobre el cual actúan (Mejía & Rosero, 2012). Las enzimas salivales son elementos fundamentales en las importantes funciones que desempeña la saliva en el metabolismo. La enzima α-amilasa salival es una enzima cuya función consiste en la digestión bucal del almidón proveniente de la dieta. Cataliza la ruptura de los enlaces polimerizantes α-1,4, acción determinada por la estructura de su centro activo.  (García, et al., 2012).  La concentración de sustrato es uno de los factores principales que determinan la velocidad de la reacción enzimática (Martínez 2012), además el pH y temperatura son variables que afectan de forma notable las interacciones entre sustrato y enzima (Zúñiga, S., 2016). Se pretende hacer una evaluación de cómo y en qué medida las reacciones enzimáticas llegan a ser afectadas tras la modificación drástica de concentración temperatura y acidez en el medio de reacción.

Materiales y métodos

• Soluciones buffer 0.1 M: De citrato con pH=3.0, citrato con pH=4.0 fosfato con pH=5.0, fosfato con pH=7.5, borato con pH=9.0, borato con pH=10.0 y de carbonato con pH=11.
• Solución de almidón al 0,5 %.
• Solución de almidón extraído de arroz.
• Solución salina (solución NaCl al 0.85 %).
• Solución de Lugol: 5 mmoles de I2 por litro de KI (30 g/L).
• Solución acuosa de saliva (fuente de la α-amilasa) en diferentes proporciones.
• Guantes.
• Fotocolorímetro
• Tubos de ensayo

• Evaluación del cambio de pH sobre la actividad de la enzima amilasa.

Se prepararon 8 mL de solución de saliva al 25%, lo cual se hizo disolviendo 2 mL de saliva en 8 mL de solución salina. En 8 tubos de ensayo se agregaron 4 mL de una solución buffer con los siguientes pH respectivamente: 3.0; 4.0; 5.0; 7.5; 9.0; 10; 11; 7.5, a cada tubo (excepto el N°8) se le agregó 1 mL de solución de saliva al 25% y se incubaron en baño maría a 37°C durante 5 minutos, una vez transcurridos los 5 minutos se retiraron los tubos del baño para adicionarles 1 mL de solución de almidón y 2 mL de solución salina y se volvieron a incubar durante 5 minutos. Una vez que se retiraron los tubos del baño María se les agregó 3 gotas de Lugol a cada uno, se mezcló para finalmente medir la absorbancia en el fotocolorímetro.

• Evaluación del cambio de concentración de la enzima sobre la reacción de hidrólisis de la amilosa.

Se prepararon 7 soluciones acuosas de saliva con las siguientes concentraciones: 50%; 25%; 12.5%; 6.2%; 3.1%; 1.6%; 0.8%, para preparar dichas soluciones primero se mezcló 1 mL de saliva con 1 mL de solución salina (se obtuvo solución de saliva al 50%), luego se tomó la mitad de la solución al 50% y se mezcló con 1 mL de solución salina, ese proceso se repitió 6 veces tomando la mitad de solución resultante hasta obtener una solución de saliva al 0.8%. Posteriormente se marcaron 7 tubos de ensayo con los números del 1 al 7, a cada uno se le agregó 4 mL de buffer pH=7.5, 2 mL de solución salina al 0.85% y 5 mL de almidón al 0.5%, los tubos se incubaron durante 5 minutos en baño maría a 37°C, después esto se le adicionó a cada uno 1 mL de solución de saliva de diferente concentración (50%; 25%; 12.5%; 6,2%; 3.1%; 1,6% y 0.8%) y se volvieron a incubar durante 5 minutos. Luego de ser incubados se les agregó 3 gotas de Lugol a cada uno y se midió su absorbancia en el fotocolorímetro.

• Evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la amilasa.

Para evaluar el efecto de la temperatura en la actividad catalítica de la enzima en cuestión se prepararon cuatro ambientes distintos: un baño de hielo a 4°C, temperatura ambiente, un baño a 37°C y un baño de agua hirviendo a 94°C. En cada uno de los ambientes se incubó durante 5 minutos un tubo de ensayo con 1 mL de solución de saliva al 25% y 4 mL de solución buffer pH=7.5, una vez transcurridos los 5 minutos correspondientes los tubos se dejaron reposar en un baño de agua a temperatura ambiente, se les adicionó 2 mL de solución salina y 4 mL de solución de almidón y se introdujeron todos los tubos en el baño de 37°C durante 5 minutos. Por ultimo se adicionó a cada tubo 3 gotas de Lugol, se agitó y se midió la absorbancia de cada muestra en el fotocolorímetro.

...