Aisalimiento de DNA plasmídico

INTRODUCCIÓN

El termino DNA se refiere al acido desoxirribonucleico el cual es el portador de la información genética en todas las células y muchos virus. Un plasmído es un pequeño DNA circular capaz de replicarse desde una bacteria.

La electroforesis es una técnica en la cual se aplica un campo eléctrico para que haya una migración de iones. En principio, una molécula cargada se mueve en un campo eléctrico con una variedad proporcional a su densidad de carga general, tamaño y forma. Para moléculas con una composición relativamente homogénea (como los ácidos nucleicos), la forma y la densidad de carga son constantes, por lo que la velocidad depende en mayor medida del tamaño. La electroforesis se lleva a cabo en una matriz similar a un gel, en general formada por agarosa (polímeros de carbohidratos que forman un retículo flojo) las moléculas a separar se aplican en uno de los extremos del gel, y se mueven a través de los poros de la matriz bajo la influencia del campo eléctrico. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido por lo que se mueven más rápidamente a través del gel y por ello migran más lejos en un tiempo dado.

Las moléculas separadas pueden visualizarse en el gel con una técnica como la adición de un colorante que se una estrechamente al DNA; en este caso el bromuro de etidio cumple con esta función. Ya que es una molécula plana que se puede introducir entre los pares de bases de las cadenas del DNA para marcarlo, el bromuro de etidio fluoresce con la luz ultravioleta.

OBJETIVOS

Aislar DNA plasmídico bacteriano.

Analizar la técnica que se lleva a cabo para extraer dicho DNA

Comprobar dicho aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa.

ANALISIS DE LA TÉCNICA

Las bacterias crecieron en medio Luria-ampicilina para poderlas hacer resistentes a este fármaco. Se centrifugo a 13000 rpm por 5min, se desecho sobrenadante para solo obtener nuestras bacterias en el precipitado, posteriormente se agrego 100 μL de la solución I, la cual es glucosa-Tris-EDTA- RNasa A, ésta solución tiene varias funciones, la glucosa nos mantiene la bacteria completa, el Tris nos amortigua el pH entre 8 y 8.5, haciendo que el DNA tenga una carga negativa a este valor de pH, el EDTA, se une a cationes divalentes en la bicapa lipídica, debilitando así la envoltura celular, después de la lisis celular, inhibe la degradación de DNA por iones Magnesio que son cofactor necesario para las enzimas nucleasas; el RNasa A es una enzima que degrada el RNA.

Siguiendo la técnica se agregaron 200 μL de la solución II y se mezclo suavemente para evitar daño al DNA, la solución contenía SDS 1%-NaOH 0.2 N, el SDS disuelve proteínas y la membrana celular, es decir los componentes lipídicos. El NaOH desnaturaliza el ADN cromosómico, quita impurezas, mientras el ADN plasmídico queda intacto.

Se agrego posteriormente 150 μL de la solución III y se mezclo e incubo en hielo 10 min en hielo. La solución es Acetato de potasio 5M pH 4.8. Esta solución hace que el DNA cromosómico precipite, junto con otras proteínas y el DNA plasmídico quede en solución, se centrifugo y se separo el sobrenadante en otro tubo a este se agrego solución IV, (Isopropanol), se mezclo suavemente y se incubo 5 min en hielo, aquí el alcohol precipita a los ácidos

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