IBMC- PREPARACIÓN DNA PLASMÍDICO

TRABAJO PRÁCTICO 2

PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO

DE Esterichia coli

GRUPO 8:

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA circular que se encuentran en bacterias, como Escherichia coli y también en algunas células eucariotas. No son esenciales para la vida de la bacteria, sin embargo, llevan información genética importante, que les permiten sobrevivir en condiciones desfavorables, o competir con otros microorganismos en el mismo nicho ecológico. Algunos ejemplos:

• Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en bacterias del género Rhizobium.

• Resistencia a antibióticos (plásmidos R), metales pesados (mercurio).

• Plásmidos de virulencia: producen toxinas, factores de penetración de tejidos, adherencia en los tejidos del hospedador.

• Inducción de tumores en plantas dicotiledóneas.

• Producción de bacteriocinas ( proteínas tóxicas producidas por bacterias que eliminan a otras de la misma especie).

• Producción de sideróforos (quelatos capaces de incorporar iones Fe3+.

• Utilización de determinados azúcares.

• Utilización de hidrocarburos (degradación de tolueno, xileno, alcanfor) en Pseudomonas.

Diferentes plásmidos pueden coexistir en una célula, aunque durante la división celular, las moléculas de DNA plasmídico segregan al azar sus células hijas, por lo que, a lo largo de varias generaciones, el plásmido podría perderse. En ausencia de una presión selectiva, los plásmidos compiten dentro de la célula, y al cabo de varias generaciones, uno de ellos permanecerá dentro de la célula, mientras que el otro será excluido, a esto se lo conoce como incompatibilidad plasmídica (solo ocurre cuando los plásmidos tienen el mismo mecanismo de control de número de copias, ORI) . Sus aplicaciones en la Biología Molecular y Celular son diversas, por ejemplo en terapia génica, vectores de clonado, vectores de expresión (los vectores son plásmidos, que permiten insertar genes foráneos en el núcleo de una célula).

En los vectores de clonado se incorpora una secuencia de DNA genómico (cDNA) que se quiere clonar y amplificar en las bacterias. Estas bacterias se transforman con el plásmido/vector y se plaquean en un medio sólido, para que puedan formar colonias. Estas colonias serán provenientes de una única bacteria que haya incorporado un único plásmido (clon). Si el plásmido tiene un ORI de “alto número de copias”, al amplificar el clon se logra amplificar el inserto como consecuencia de la multiplicación del plásmido.

En los vectores de expresión, además de colocar el inserto (cDNA) se colocan secuencias regulatorias y/o promotores para controlar la expresión (trascripción y traducción) del gen codificado por el inserto. Con esto se puede expresar la proteína para estudiar su función o purificarla, también se puede estudiar la regulación de su expresión.

Elementos más importantes del plásmido pBluescript II KS/SK (+)

-ORI o rep (Pmbi): es el orígen de replicación de alto número de copias.

-Gen bla (ApR) de resistencia a antibióticos (amplicilina): codifica para la β-lactamasa, que es una enzima que degrada a la amplicilina y le permite a la bacteria sobrevivir en un medio que contiene este antibiótico.

-Polylinker o sitio múltiple de clonado (MCS): contiene secuencias únicas de reconocimiento para varias enzimas de restricción.

-Promotores PT3 y PT7: en presencia de RNA pol de los bacteriófagos T3 y T7, se puede dirigir la transcripción del inserto en uno u otro sentido.

-Lac Z: codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual degrada a la lactosa.

-F1: origen de replicación viral para obtener DNA de cadena simple.

OBJETIVO

Se procederá a extraer DNA plasmídico, mediante la utilización de diferentes soluciones:

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