Aumento de la solubilidad de eritropoyetina recombinante humana mediante proteínas de fusión CuSF y SmbP

Daniela Nataly Castillo Cardona, José Miguel Hernández Rojas, Ángel Osmar Ordoñez Blancas, Sara Fabiola Saucedo Gutiérrez

Equipo 2

Aumento de la solubilidad de eritropoyetina recombinante humana mediante proteínas de fusión  CuSF y SmbP

Introducción

La tecnología del ADN recombinante consiste en la unión de secuencias de ADN provenientes de organismos ajenos entre sí. Dando como resultado una modificación genética que permite a un organismo sintetizar proteínas que no se presentaban en este originalmente. A estas proteínas se les conoce como recombinantes.

EL ADN recombinante facilita el insertar y expresar, en el genoma de un microorganismo, pequeños fragmentos del ADN diferentes al mismo. Normalmente, se utilizan bacterias como células hospedadoras por dos motivos; simplifica la producción de RNAm maduro y su proteína correspondiente, y además por su capacidad de multiplicarse de forma rápida y por un corto tiempo, facilitando su producción a gran escala.

Para la obtención de las proteínas recombinantes se emplean las proteínas de fusión, las cuales tienen la ventaja de purificarlas de forma rápida y simple. Un ejemplo de las proteínas de fusión es la SmbP (Small metal- blinding Protein) de 9.9 kDa, la cual es reconocida por producir más proteínas recombinantes solubles y el transporte de estas al periplasma si este presenta señales peptídicas. Así como la CuSF, con un peso molecular de 10 kDa, la cual es una proteína periplasmatica conocida por tener una función en la resistencia de la E. coli, elevando los niveles de los iones cobre y plata.

Una de las técnicas que se han utilizado recientemente, desde su aprobación en 1989 para pacientes anémicos [1], como el tratamiento de la insuficiencia renal, es la producción de la eritropoyetina humana recombinante (20 kDa), donde se puede apreciar una mejoría entre 1 y 2 semanas posteriores al tratamiento con una dosis de 2 a 3 veces por semana, lo cual llega a evitar la necesidad de transfusiones y hemodiálisis. Además de esto, va a traer consigo un aumento en la supervivencia de los eritrocitos y varias aplicaciones en otras células diana, como la neuro protección. [2]

El mecanismo de acción de la eritropoyetina sucede mediante el receptor de la EPOr, que está conformado por tres dominios; extracelular, intracelular y transmembranal. Una molécula de eritropoyetina se une a dos de los receptores extracelulares, desencadenando una reacción de fosforilación que se lleva hasta el dominio intracelular, donde, por mecanismo de diferenciación genética, alterará los tiempos de vida, reproducción y muerte de las células.  

Para la obtención de la eritropoyetina recombinante humana existen diversos métodos, que se basan en la tecnología recombinante. Una de las formas es mediante la Escherichia coli, siendo esta la bacteria más utilizada, debido a que es fácil la producción de proteínas heterólogas por su sencilla edición genética, su habilidad para realizar cambios conformacionales a estructuras terciarias de las proteínas y lo económico que es a comparación de otros modelos.

Dentro de las variedades de E. coli se ha optado por utilizar a la subespecie Shuffle, debido a que esta hace modificaciones postraduccionales añadiendo puentes disulfuro, dándonos así estructuras terciarias en su forma activa para no necesitar de otros mecanismos para hacer modificaciones en la estructura de la proteína.

Planteamiento

La eritropoyetina recombinante humana ha sido de gran interés por su efectividad al tratar a los pacientes de insuficiencia renal crónica. La insuficiencia renal es una enfermedad común hoy en día, siendo esta una condición donde hay una pérdida de funcionalidad de las nefronas por lo que los riñones no son capaces de eliminar los productos finales del metabolismo que se encuentran en la sangre. [1] Así como de regular el equilibrio hidroelectrolítico y el estado ácido-base de los líquidos extracelulares. Debido a esto, hay una variedad de padecimientos que se derivan por esta enfermedad. Como lo son la enfermedad ósea dinámica, osteomalacia, hiperplasia en las glándulas paratiroides, enfermedades coronarias y anemia, entre muchos otros.

La anemia derivada de una insuficiencia renal se caracteriza por una disminución en los niveles de todas las células sanguíneas, esto es causado por la falta de estimulación de la medula ósea, causada por una baja producción de eritropoyetina, una de las hormonas glicoproteícas producidas en el riñón.

Por consiguiente, se han buscado tratamientos para la anemia, los cuales dependerán del daño renal que haya al momento de la detección de la enfermedad, esto para evitar más efectos adversos que beneficios. Donde se incluyen una disminución en la ingesta de proteínas, el uso de antihipertensivos como protección renal, hemodiálisis, y en casos más graves, un trasplante de riñón. En la actualidad, la insuficiencia renal crónica es la quinta causa de muerte en México según el INEGI, reportando casos de al menos 500 enfermos por cada millón de habitantes. [3] Estos números son altos debido a que la insuficiencia renal puede ser causada por diabetes, enfermedad con mucha influencia en México, ya que es la segunda causa de muerte. Además de que los efectos de la quimioterapia pueden afectar la producción de eritrocitos.

Justificación

Los tratamientos de estas patologías pueden llegar a ser costosos e imprácticos, como la trasfusión de sangre la cual puede llegar a ser administrada cada 3 días, afectando más a personas de recursos limitados. Es por esto que la producción de la eritropoyetina se ha vuelto de gran importancia en el ámbito médico, ya que esta es de fácil administración, ha demostrado tener buenos resultados y a comparación de los demás tratamientos, es una alternativa barata.

De esta manera, nuestro proyecto sirve como una alternativa más económica a los procedimientos actuales, por la simplificación del proceso. Esto se debe a que E. coli es una bacteria cuya mutación es sencilla, pero además de esto, es capaz de hacer los cambios post traduccionales que permiten obtener la proteína de interés en una manera activa, fácil de purificar y una cantidad mucho menor de pasos a comparación de otros métodos. Todo esto, hace que la producción de eritropoyetina pueda realizarse a mayor escala en menor cantidad de pasos, con la ventaja de menos requerimientos alimenticios que en otros métodos que utilizan seres vivos para producir esta proteína. Podemos traducir esta reducción de pasos y menor requerimiento en un menor gasto para poder producir nuestro compuesto de interés. Tomando en cuenta que las empresas que fueron las primeras en comercializar EPO para diferentes enfermedades generan ingresos de entre 1700 a 3600 millones de dólares. [12]

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