Cromatografia Fina

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y ocasionalmente para separar cadenas cortas de polipéptidos y ácidos nucleicos. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos.

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se verán los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador dependerá del tipo de moléculas que se analizan.

Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina

- éter de Petróleo - cloruro de metileno

- n-hexano - acetato de etilo

- ciclohexano - acetona

-‘tolueno - iso-propanol

- dietil-éter - etanol

- t-butil-éter - metanol

- cloroformo - ácido acético

Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante:

a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F25a ó F366), el número que

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