Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificación de microorganismos

Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificación de microorganismos.

Resumen.

Existen formas de realizar estudios cuantitativos de las colonias bacterianas de forma indirecta y directa. En el presente documento se exponen los resultados de la cuantificación de microorganismos de una colonia de E. coli por turbidimetría y por recuento directo. Partiendo de una hora inicial, se midió la absorbancia en el espectrofotómetro de la muestra y se realizó el conteo en la cámara de Neubauer (tomando 10 cuadros) comenzando 2,75 horas después, y repitiendo cada media hora. Debido a que se empezó a hacer la cuantificación tarde, no se pudo certificar fase de latencia, ni la duración de la fase exponencial. No obstante, se determinó por ambos que la colonia se encontraba en la fase estacionaria. Las discrepancias entre resultados correspondieron a errores de observación, principalmente la dificultad de diferenciar células vivas y muertas por el método de recuento directo.

Palabras clave: E. coli, recuento directo, tubidimetría, fase estacionaria, cámara de Neubauer.

Abstract.

There are several ways to make cuantitative studies of bacteria colonias by indirect and direct methods. In this paper the results of a cuantitative study of the microorganisms in an E. coli  colony by turbidimetry and direct counting will be exposed. Taking an inicial time, the absorbance was measured in the spectrophotomer and a the number of cells was determined by counting in a Neubauer chamber (taking 10 squares) starting 2,75 hours after, and repeating each 30 minutes. Due the counting was started late, it could not certifiacte the lag phase and the exponencial phase duration neither. However, is was determined by both methods the colony was in stationary phase. The discrepancies between the results correspond to observation mistakes, mainly the difficulty for differentiate between living cells and dead cells by direct counting.

Keywords: E. coli, direct counting, tubirdimetry, stationary phase, Neubauer chamber.

Introducción.

La cuantificación de microorganismos se puede realizar de forma directa o indirecta partiendo de una muestra. Los métodos directos consisten en determinar el número de microorganismos presentes a partir de un conteo individual de las células presentes en un espacio determinado para estimar el número de microorganismos en la muestra. Los métodos indirectos consisten en medir una característica de la muestra que permita determinar la densidad de microorganismos en ella, como la turbidez. (Madigan et al, 2003).

El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante la medida de la masa celular total, que generalmente es proporcional al número de células. El recuento directo de bacterias al microscopio es una técnica directa usada para determinar el número de células por unidad de volumen o de peso presentes en materiales tales como cultivos líquidos, leche, alimentos y otros. Para esto se usan las cámaras de recuento como Neubauer, este método es rápido y preciso pero no es posible distinguir las células viables de las muertas. El hematocitómetro o cámara de Neubauer se trata de una capa gruesa de cristal con forma de portaobjetos que presenta una cuadrícula grabada, la retícula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadros de 1mm de lado cada uno; estos cuadrados son destinados al recuento de células, en donde se cuenta el número de células en 10 cuadros y luego se halla un promedio (Rodríguez et al, 2005).

Un método indirecto muy común es la turbidimetría. Se usa para la determinación de aminoácidos, proteínas y vitaminas, y también para el control de crecimiento bacteriano en un medio de cultivo líquido. (Oslen, 1990). Este método se basa en la medición de la turbidez, siendo una muestra más turbia a medida que cuenta con una mayor cantidad de células que dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Esta magnitud puede medirse con un especrofotómetro, que hace pasar la luz a través de las suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no dispersada. (Madigan et al, 2003).

Los resultados de los métodos descritos varían de acuerdo a la fase de crecimiento en la que se encuentra la colonia. Dichas fases son: la fase de latencia, en donde la bacteria es inoculada en un nuevo medio y el crecimiento no comienza inmediatamente, se necesita que los microorganismos produzcan las enzimas necesarias para crecer en el nuevo medio; la fase exponencial, donde se registra el mayor crecimiento bacteriano, pero se ve afectada por condiciones del medio; la fase estacionaria, donde el crecimiento de la colonia llega a su límite ya sea porque un nutriente esencial para las bacterias se agota, se acumulan sustancias tóxicas en el medio, no queda; y la fase de muerte, donde la población bacteriana empieza a reducirse. (Universidad de Caracas).

Metodología.

Materiales:

-Gotero Pasteur.

-Tubos de ensayo.

-Cámara de Neubauer.

Equipos:

-Espectrofotómetro.

-Microscopio óptico.

Métodos:

-Se tomaron diferentes muestras de una muestra original de cultivo de E. coli en 5 diferentes tubos de ensayo a distintos tiempos.

-De cada muestra se midió la absorbancia con el espectrofotómetro.

-Se procedió a realizar el conteo de las bacterias usando para ello la cámara de Neubauer y el microscopio óptico. Se realizó el conteo en 10 cuadros por cada muestra tomada para calcular la cantidad de microorganismos por mL.

Discusión.

La tabla 1 resume los resultados de la medición de la densidad óptica (absorbancia) y el número de células presentes en una muestra conforme pasaba el tiempo. Para determinar el número de microorganismos por mililitro se aplicó:

[pic 1]

Donde las dimensiones del cuadro fueron todas de 0,1 cm, por lo que el volumen es de 0,0001 mL y se tomó una disolución no diluida, siendo este factor 100.

Tabla 1. Densidad óptica y número de células de E. coli desde su inoculación.

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