Determinacion de proteinas en la leche en polvo

Instituto Tecnológico Superior de Santiago Papasquiaro

ING. Industrias Alimentarias 

Bioquímica de los Alimentos 1

Práctica 6

“Cuantificación de proteínas ”

M.C. Erica Córdova Gurrola

Alumnos:

Adriana Estrada Ramírez

Juan Roberto Reyes Chávez

Anahí Corral Nuñez

Introducción:

La leche en polvo entera es un alimento muy rico en proteínas (23 g. cada 100 g.). Dada su alta cantidad de proteínas, la leche en polvo entera es un alimento recomendado especialmente para el desarrollo muscular. Se determinó a través del método de Biuret que se basa en la formación de un complejo coloreado ente el CU2+ y los grupos NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas el complejo presenta un color violeta.

Se tomaron 6 muestras con distintas concentraciones de proteína sintética para medir la absorbancia en el espectrofotómetro el cual es un instrumento utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas, ayuda a determinar cuáles sustancias (proteínas, carbohidratos) están presentes en la muestra) calibrado a 540 nm para realizar la curva patrón y determinar gráficamente la concentración de proteínas de la muestra de disolución de leche que se realizó por triplicado para obtener un valor promedio con su respectiva desviación estándar.

Objetivo:

Cuantificar las proteínas presentes en una muestra de leche en polvo diluida a través del método de Biuret, realizar la curva patrón con la absorbancia y determinar la concentración de proteína en la muestra de leche por triplicado

Marco teórico

La leche es  una de las comidas más nutritivas y completas para el desarrollo humano, se compone de dos principales grupos, carbohidratos y proteínas. En la leche la proteína más importante es la Caseína, seguida por proteínas séricas albumina y globulina. El contenido total de proteínas va de 32 a 33 gramos por litro. (lubert,2008)

La leche entera en polvo también es un alimento muy rico en vitamina B2(1.40mg cada100g) y potasio (1160 mg cada100g) calcio(1047mg cada 100g) y proteínas (23 g, cada 100g) (Paladin,1968)

Dada su alta cantidad de proteínas la leche en polvo es un alimento recomendado para el desarrollo muscular. Los alimentos ricos en proteína como esta leche están recomendados durante la infancia, la adolescencia y el embarazo, ya que en estas etapas es necesario un mayor aporte de este nutriente. (braverman 1967)

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. (Segal, 2005)

Método de Biuret  

 Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).  El    complejo presenta un color violeta característico,  que se puede observar a 310nmo540-560nm,  el cual se da por la  coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno (segal, 2005)

Espectrofotómetro

El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Esto quiere decir que este instrumento nos ayuda a determinar cuáles sustancias (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, entre otras), están presentes en una disolución y en qué cantidad.( Cambell,2006)

Los espectrofotómetros pueden emitir radiaciones de diferentes longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. (Cambell, 2006)  

Curva patrón

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)

[pic 1]

Figura 1: ejemplo de curva patrón

(Harris,2003)

Si se desea preparas Disoluciones seriadas se debe considerar la siguiente formula

C1V1=C2V2

Donde:

V1=volumen de la solución inicial necesitado para preparar la nueva solución

V2=volumen final de la nueva solución

C1= concentración de la solución inicial

C2= concentración final de la nueva solución

 (Guerrero y G.M. Díaz 2007)

Materiales y métodos

•2 Pipetas

•1 Probeta de 50ml

•2 Vasos de precipitado 250ml

•1 Agitador

•9 Tubos de ensayo

•1 Gradilla

•Leche en polvo

•Reactivo Biuret

•Disolución patrón 4mg/L

•H2O destilada  

Se etiquetaron 6 tubos de ensayo con una solución que contenía: tubo 0 (0ml de solución patrón, 1ml de agua y 4ml de Biuret); tubo 1(0.2ml de solución patrón, 0.8ml de agua y 4ml de Biuret); tubo 2(0.4ml de solución patrón, 0.6ml de agua y 4ml de Biuret); tubo 3(0.6ml de solución patrón, 0.4ml de agua y 4ml de Biuret); tubo 4(0.8ml de solución patrón, 0.2ml de agua y 4ml de Biuret); tubo 5(1ml de Solución patrón, 0ml de agua y 4ml de Biuret). Después se tomaron 3 tubos y se etiquetaron y tenían una disolución de 4ml de Biuret, 0.5ml de agua y 0.5ml de muestra en ambos tubos, la muestra es una solución de: 6g de leche/50ml de agua y de esa solución se tomaron 2ml/8ml de agua que sería nuestra muestra. Después se llevaron estas muestras al espectrofotómetro, donde se calibro a 540 nm con el tubo 0, después se colocaron los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 dentro del espectrofotómetro y se anotaron las lecturas correspondientes, después se retiraron el 5, 4 y 3 para colocar los otros 3 tubos que tenían la muestra y también se anotaron las lecturas; con esas lecturas pudimos determinar las lecturas de absorbancia en las disoluciones y calcular lo que se quería determinar.

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