INFORME DE LABORATORIO Cuantificación Espectrofotométrica de Aminoácidos y Proteínas

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INFORME DE LABORATORIO

Cuantificación Espectrofotométrica de Aminoácidos y Proteínas

Bioquímica general

Autores: Arjona, Colomba

García, Selenna

Oñate, Adolfo

Profesor: Sebastián Ramírez

Ayudante: Álvaro Neira

Fecha: 16/04/15

Introducción: 

Los aminoácidos son la base de todo proceso vital porque son necesarios en todos los procesos metabólicos. Cumplen diversas funciones en el organismo como agentes transportadores, neurotransmisores, reguladores de pH y es la unidad básica de las proteínas. Estas forman parte de las estructuras y funciones en las células como las enzimas o el citoesqueleto. Si queremos determinar la concentración de proteínas de estado biológico existen diversos métodos dependiendo del origen de la muestra, el medio en el que está presente o la efectividad que tenga el método. En este experimento se va a determinar la concentración de 2 aminoácidos y una proteína utilizando la ley de Lambert-Beer a 280 nm, Posteriormente se va a determinar la concentración de proteínas en dos muestras problema  a partir de la construcción de una curva de calibración utilizando una solución estándar de Seroalbumina de Bovino (SAB) a una concentración conocida de 5 mg/mL.

Objetivos:

• Conocer los fundamentos teóricos y prácticos de la espectrofotometría.
•  Determinar la concentración de aminoácidos y proteínas en solución.

Procedimiento experimental:

1. Reconocimiento y cuantificación de aminoácidos y proteínas por absorbancia 280 nm.

Para realizar este experimento, en primer lugar utilizamos una micropipeta p1000, con la cual se completó 4 tubos previamente rotulados con 3 mL de una solución distinta a cada uno: tubo 1 = NaCl 0,9 p/v, tubo 2 = glicina, tubo 3 = triptófano, tubo 4 = SAB. Luego se leyó la absorbancia de cada solución a 280 nm en cubetas de cuarzo manteniendo la rotulación de los tubos anteriores en las cubetas. Para esto se colocó la sustancia del tubo 1 y se blanqueó la muestra, posteriormente se puso la cubeta con la muestra 2 quitando la primera y se le midió su absorbancia. Después se quitó la cubeta 2 y se cambió por la 3 y se leyó la absorbancia, se realizó el mismo procedimiento para la solución número 4.

1. Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

En este experimento se completaron 8 tubos con tres soluciones diferentes distribuidas en distintas cantidades en mL dependiendo del tubo al cual se agregaron: tubo 1 = 2mL de NaCl 0,9% p/v, tubo 2 = 1,8mL de NaCl 0,9% p/v y 0,2mL de SAB 5 mg/mL, tubo 3 =  1,5mL de NaCl 0,9% p/v y 0,5mL de SAB 5 mg/mL, tubo 4 = 1mL de NaCl 0,9% p/v y 1mL de SAB 5 mg/mL, tubo 5 = 0,5mL de NaCl 0,9% p/v y 1,5mL de SAB 5 mg/mL, tubo 6 = 2mL de SAB 5 mg/mL, tubo 7 = 2mL de muestra problema 1 (clara de huevo), tubo 8 = 2mL de muestra problema 2 (orina). Luego de haber completado los tubos con las porciones ya antes mencionadas se les agregó 2mL de reactivo de Biuret a cada tubo con una micropipeta p1000 y se mezclaron suavemente. Ya completado este procedimiento se leyó la absorbancia de cada tubo a 545 nm en cubetas de plástico y se anotaron los resultados.

Resultados:

1. Reconocimiento y cuantificación de aminoácidos y proteínas por absorbancia 280 nm.

Luego de tomar la absorbancia de las soluciones obtuvimos los siguientes resultados; tubo 1 (blanco) = 0: tubo 2 = 0,019: tubo 3 = 0,785: tubo 4 =0,953. Luego de obtener estos resultados determinamos la concentración en mg/mL de cada muestra utilizando la ecuación que expresa la ley de Lambert – Beer y los coeficientes de extinción molar a 280 nm que nos entregaron en la guía (SAB y triptófano) obteniendo que la concentración del SAB es igual a 2,174x10-5 mg/mL y la del triptófano 1,379x10-4 (Ver anexo N°1)

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