Laboratorio, Separación De Proteinas

Informe laboratorio, separación de proteinas

Introducción

Las proteínas son una componente indispensable para el organismo, presentes en todo ser vivo, pueden presentar funciones como: Estructural (colágeno y queratina)Reguladora (insulina y hormona del crecimiento),Transportadora (hemoglobina),Defensiva (anticuerpos),Enzimática (sacarasa y pepsina),Contráctil (actina y miosina). Son una cadena larga de aminoácidos, y son llamadas macromoléculas por su gran tamaño, y sus propiedades corresponden a solubilidad, especificidad y son amortiguadores de pH.

la obtención de proteínas de tejidos vivos debe realizarse con el cuidado de liberarla sin alterar sus propiedades elementales, siendo posible renaturalizarlas, y la elección del método debe realizarse en base a rendimiento y grado de purificación que sea capaz de entregar. El criterio de separación de proteínas se basa en tamaño, diferencia de solubilidad, carga, y especificidad de ligandos, etc.

Las proteínas a utilizar en el taller fueron obtenidas a partir de intestino de rata, sometida previamente a una dieta a base de pellet y leche.

Objetivos

Extracción de proteínas de intestino de rata alterando su estructura de forma reversible

Conocer diferentes tecnicas utilizadas para aislar proteínas a partir de fuentes celulares diversas

Razonar sobre la relacion de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas

Hipotesis: se espera que la tecnica con mayor rendimiento sea la de la acetona, pues porwue al ser un solvente menos polar que el agua deshidratará la proteina, causando la precipitacion por agregacion, ademas, la acidez de la acetona, acercara el pH de la proteina a cero, por lo cual preecipitará, aprovechando esta tecnica 2 de las propiedades de las proteinas.

Materiales:

- 1 Mortero

- 1 Pipeta de 1mL

- 1 Pipeta de 10 mL.

- 1 Vaso Precipitado de 50 mL

- 2 Tubos de centrífuga

- 1 gradilla de 12 tubos

- Pinza de Mohor

- Geringa de 10 mL

- Manguera

- Soporte Universal

- Placa de agitación

- Agitador magnético

- Bolsa de diálisis

- Centrífuga

EFECTO DE LA FUERZA IONICA DEL MEDIO

A) Precipitación de proteínas con sales

La solubilidad de las proteínas depende entre otras cosas de la concentración de sal en la solución. En las concentraciones bajas, la presencia de sal estabiliza a los varios grupos cargados en una molécula de proteína, así atrayendo la proteína en la solución y realzando la solubilidad de la proteína. Esto se conoce comúnmente como “salting-in”. Sin embargo, como se aumenta la concentración de la sal, generalmente se llega a un punto de solubilidad máxima de una proteína. El aumento posterior en la concentración de la sal implica que cada vez hay menos agua disponible para solubilizar la proteína. Finalmente, la proteína comienza a precipitarse cuando no hay suficientes moléculas de agua a obrar recíprocamente con las moléculas de proteína. Este fenómeno de la precipitación de la proteína en presencia de exceso de sal se conoce como “salting-out”.

El sulfato de amonio que se uso en la experiencia, es excelente componente para la llamada precipitación fraccionada, porque entre otras cosas, hace que el agua compita entre la disolución de esta sal y la proteína (formada por muchos grupos carboxilo y amonio), causando que precipite la proteína.

B) Separación de proteínas de una solución salina por diálisis

En la purificación de proteínas, las proteínas globulares en disolución pueden separarse fácilmente de los solutos de bajo peso molecular por diálisis mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de la presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una membrana semipermeable. Puesto que la membrana que contiene la disolución de proteínas es semipermeable, el agua y los solutos tales como la glucosa o el sulfato de amonio atraviesan la membrana libremente pero las proteínas no lo hacen. Esto porque las porosidades de esta membrana retienen las moléculas de mayor peso molecular (proteínas) y solo deja pasar moléculas de pequeño peso molecular. Sustituyendo así varias veces la fase acuosa externa con nuevo volumen de agua destilada, la concentración de las moléculas pequeñas de soluto en la disolución de proteína puede reducirse a una cantidad despreciable.

De esta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales.

En la experiencia se uso reactivo de Biuret para reconocer proteínas en el contenido interior de la bolsa de membrana semipermeable después de haberse realizado la diálisis. El reactivo de biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias al NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

También se realiza un ensayo con solución de AgNO3 en el líquido del vaso en donde está inmersa la bolsa semipermeable para demostrar la presencia de cloruros provenientes de las sales del extracto de intestino de rata. Esta se observa al formarse un precipitado blanco (en la experiencia se observo débilmente) debido a que se forma AgCl, un compuesto insoluble en agua.

Separación de proteínas de una solución salina por cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil ( que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad

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