TEMA DE ELECTROFORESIS SEMINARIOS

ELECTROFORESIS

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular.

Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas.

Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.

PRINCIPIO

La electroforesis es una herramienta que se utiliza para la separación, identificación y purificación de proteínas. En un principio se utilizaron geles de almidón, pero posteriormente se reemplazaron por geles de poliacrilamida, impartiendo a las proteínas una carga negativa, misma que ocasiona que migren al ánodo de un circuito eléctrico. El principio que se utiliza en electroforesis se fundamenta en la atracción de cargas eléctricas. Cuando una proteína presenta una carga eléctrica neta, en un campo eléctrico se desplazará al electrodo con carga contraria. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa, más rápida será la migración.

PASOS

1. PREPARACION DE LOS GELES

En primer lugar, el cristal superior se sitúa con el separador y ambos se fijan con el soporte y ambos se fijan con el soporte de esta forma queda un espacio de 0.75mm

Primero se prepara el gel separador

Añade agua destilada, el tampón del gel separador con PH de 8.8, luego la mezcla de acrilamida/bis acrilamida al 30% y el SDS que es un reactivo que evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular y la polimerización del gel se inicia añadiendo persulfato de amonio. Y por ultimo el reactivo de TEMED que completa la polimerización.

La mezcla debe agitarse bien para una completa homogenización.

Una vez homogénea se añade al espacio que queda entre los cristales, la mezcla debe ocupar una tercera parte del volumen total.

Al poco tiempo la mezcla habrá polimerizado completamente.

Ahora se prepara el gel Concentrador

De la misma forma que preparamos el gel separador aquí cambian las condiciones de los componentes cambian para generar un tamaño de poro mayor, el ph también se reduce a 6.8.

El gel concentrador se sitúa en la parte superior, su función es la de concentrar las proteínas antes de su separación.

Finalmente se coloca el peine, esta pieza de plástico nos permite dar forma a los pocillos donde cargaremos las muestras.

Con el gel concentrador en la parte superior y el gel separador en la parte inferior.

Ese gel se sujeta a una serie de soportes que nos permiten fijarlo a la cubeta de electroforesis, el soporte central contiene los electrodos que nos permitirá suministrar corriente eléctrica al sistema. Una vez en contacto con el tampón de electroforesis.

Una vez en la cubeta se añade el tampón de electroforesis de la tal forma que cubra la totalidad del gel, el peine se retira para para acceder a los pocillos y cargar las muestras.

2. APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Esa pieza amarilla es una guía que permite identificar una vez situado en la parte superior la posición de los pocillos, con la posición de los pocillos se pueden cargar las muestras en el lugar indicado.

Las muestras son preparadas en un tampón de cargar que contiene glicerol que permite aumentar la densidad de la muestra y que esta se deposite en el fondo del pocillo inundado además contiene un colorante el azul de bromofenol que nos indicara la posición de las muestras durante la electroforesis.

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