TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 “ENZIMAS”

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5

“ENZIMAS”

Coliboro Paola

Química Biológica

2011

INTRODUCCION

Las funciones vitales de la célula no son ms que una serie de reacciones químicas, las células vivas obtienen energía oxidando el carbohidrato glucosa a dióxido de carbono y agua a una temperatura (en el ser humano) de 37C. El ingrediente secreto en los organismos vivos es la catálisis, un proceso efectuado por catalizadores biológicos, las enzimas proteinicas. Su arquitectura tridimensional les confiere gran especificidad para seleccionar las moléculas de sustrato a las que se unirán y sobre las cuales operaran. Estos catalizadores son imprescindibles para la vida, su ausencia provocaría que las reacciones se llevasen a cabo a velocidades tan lentas que no podrían satisfacerse los requerimientos celulares, por lo que la vida no seria posible. Al igual que todos los catalizadores, las enzimas aceleran las velocidades de reacción Tal variación se debe a la disminución de la energía de activación, que es la energía necesaria para convertir los reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transición. Las enzimas pueden sufrir cambios transitorios durante la reacción, pero al finalizar la misma la queda física y químicamente inalterada, además son eficaces en pequeñas cantidades. Ambas características son comunes a todos los catalizadores, sin embargo dada su naturaleza proteica la acción enzimática tiene algunas características propias:

• Son termolábiles, es decir que su funcionalidad depende de la temperatura.

• Presentan una mayor eficiencia, es decir que transforma una mayor cantidad de sustrato por unidad de tiempo.

• Poseen una alta especificidad en relación con la reacción catalizada y el sustrato.

• Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos.

• Nomenclatura y clasificación: según la reacción que catalizan

• Oxido-reductasa: catalizan reacciones de oxido-reducción, las que implican la ganancia (reducción) o pérdida de electrones (oxidación). Las más importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas.

Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a otra molécula. Pueden transferir:

Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo H y OH.

Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces.

Isomerasas: convierten los sustratos isómeros unos en otros.

Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energía de la ruptura del ATP. Ej: polimerasa

OBJETIVO

Identificar enzimas a partir de su actividad especifica.

MATERIALES

-Agua destilada

-Leche

-Pancreatina

-Rojo fenol

-Levadura

-Acetona

-Reactivo de Fehling

-Buffer de fosfato de potasio

-Hígado fresco

-Peroxido de Hidrogeno

-Glucosa

-Glucosa oxidasa GOD

-Peroxidasa POD

-Fenol

-Aminofenazona

-Azida de sodio

METODOS

Se intentara identificar algunas enzimas presente en material biológico, de forma indirecta, a partir de su actividad especifica. Se pondrá en evidencia la naturaleza proteica de estas a partir de ensayos con proteínas sometidas a desnaturalización y de la influencia de la temperatura en la actividad enzimática

1. Identificación de lipasa

La lipasa es una enzima secretada por el páncreas. presente en el intestino delgado que hidroliza los triglicéridos a ácidos grasos de cadena larga.

Técnica:

Se tomo 1 gr de pancreatina y se suspendio en 10 ml de agua destilada, luego se preparo tres tubos de la siguiente manera:

Tubo 1: se coloco 10 ml de leche, 1ml de la suspensión de pancreatina y 10 gotas de rojo fenol, se llevo a ph neutro.

Tubo 2: se coloco 10 ml de leche, 1ml de la suspensión de pancreatina previamente hervida durante 5 minutos y 10 gotas de rojo fenol, se llevo a ph neutro.

Tubo 3: se coloco 10 ml de leche, 1ml de la suspensión de pancreatina y 10 gotas de rojo fenol, se llevo a ph neutro.

Se incubo los tubos 1 y 2 a 37° C y se observo

2. Identificación de sacarasa

Técnica:

Se suspendio 1 gr de levadura en 20 ml de acetona fría, la acetona destruye las células sin atacar la enzima. Se dejo reposar la suspensión 20 minutos, luego se recupero el precipitado y coloco en un papel de filtro para secarlo. Se suspendió el precipitado en 3 ml de solución buffer de fosfato de potasio 0.5M pH 4.5.

Se agito 5 minutos y centrifugo 5 minutos a 3000 rpm, luego se recupero el sobrenadante y resuspendio en 5 ml de agua destilada. A continuación se preparo tres tubos:

Tubo 1: 1 ml de agua destilada y 1ml de la solución que contiene la enzima.

Tubo 2: 1ml de agua destilada y 1 ml de solución de sacarosa al 1 %

Tubo 3: 1 ml de solución de sacarosa y 1 ml de la solución que contiene la enzima

Se incubo los tubos 30 minutos a 37° C, y luego se realizo el ensayo de Fehling.

3. Identificación de catalasa

El peroxido de hidrógeno se descompone en agua y oxigeno por la acción de la enzima catalasa. Se coloco en un tubo 1 gota de

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