TRANSFORMACIÓN DE ESCHERICHIA COLI CON ADN PLASMIDICO

Contenido:

I   INTRODUCCIÓN

II  MÉTODOS

III RESULTADOS

IV AUTOEVALUACIÓN

I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias pueden transmitir la información genética verticalmente mediante  la división celular y reparto equitativo del material genético o bien de forma horizontal entre células que coexisten

La transferencia horizontal de genes,  también conocida como transferencia lateral de genes,  es por tanto un proceso en el que el organismo transfiere material genético a otra célula no emparentada. Este mecanismo se considera fundamental en la evolución de los procariotas.

Es el principal mecanismo por el cual las bacterias diseminan genes de resistencia a los antibióticos.

1. Mecanismos de transferencia de material genético

Existen tres mecanismos de transferencia horizontal de información genética: la conjugación la transducción y la  transformación.

1.  Conjugación

La conjugación es  la transferencia de material genético a través del contacto célula-célula y mediado por factores de fertilidad (plásmidos de fertilidad). Es un proceso de transmisión sexual de información genética.

Encontrará información más completa sobre la  conjugación bacteriana en los apuntes “on line” del Profesor D. E. Iañez

1. Transducción

La transducción es el proceso de transferencia de material genético desde una bacteria donadora a otra receptora mediada por partículas de bacteriófagos (virus bacterianos) que contienen ADN del genomio de la bacteria donadora.

Encontrará información más completa sobre la transducción en los apuntes “on line” del Profesor D. E. Iañez

1.3.Transformación 

La transformación genética es el intercambio de material genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive y expresar los genes transferidos.

Solo algunas bacterias pueden ser transformadas. Las que pueden serlo se dice que son competentes.

Encontrará información más completa sobre la transformación bacteriana en los apuntes on line del Profesor D. E. Iañez

1. Estado de competencia para la transformación

Para que se produzca la transformación de una bacteria ésta debe encontrarse en un estado fisiológico denominado “de competencia”. Las células competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede expresar sus genes en la bacteria transformada.

II. MÉTODOS

1.Material necesario

[pic 1]

• Dos tubos Eppendorf con 40 μl de células competentes de Escherichia coli  
• 2 placas de medio LB agar sin ampicilina
• 2 placas de medio LB agar con ampicilia
• 1 tubo Eppendorf con 1-2 μg de plásmido pGEM-T que es portador de un gen de resistencia a la ampilicila.
• Micropipetas de diferentes volúmenes (2,50,100 y 500 μl)
• Puntas de micropipetas estériles
• Tubo con medio LB caldo
• Baño a 42ºC
• Incubador a 37ºC
• Contenedor con hielo picado
• Tubos Eppendorf estériles

1. Caldo de LB: (Luria Bertani broth)

[pic 3][pic 2]

Medio líquido para ensayos generales de genética molecular con Escherichia coli.

Composición por Litro:

Peptona de caseína                    10g

Extracto de levadura                    5g

ClNa                                           5g

pH 7.2

2.1. Preparación de las placas de LB y LB con ampicilina

Para solidificar este medio (Agar LB) añadir 15 g de agar bacteriológico por litro. Autoclavar y repartir en placas

Para las placas de LB agar con ampicilina proceder igual que en la anterior y una vez autoclavado el medio, mantener a 50ºC para añadir el antibiótico (ampicilina).

Preparación de la Ampicilina: Preparar una solución madre 1000x de ampicilina (disolver 100mg en 1ml de agua destilada). Esterilizar por filtración.

Añadir la solución de ampicilina (1 μl por ml de medio) al medio LB agar a 50ºC y repartir en placas

3.Preparación de las células competentes de Escherichia coli

La mayoría de las células deben ser manipuladas para que se vuelvan competentes o capaces de tomar ADN de medio.

• Cultivar E. coli en medio LB
• Cuando los cultivos estén en fase exponencial se centrifugan.
• Desechar el sobrenadante y lavar las células repetidamente con solución de CaCl2 100mM
• Suspender las células en un volumen 10 veces inferior al del cultivo
• Mantener tubos Eppendorf en hielo
• Repartir alícuotas en los tubos Eppendorf preenfriados
• Almacenar rápidamente las suspensiones a -70ºC hasta que las células vayan a ser transformadas

4. Técnica de transformación

[pic 4]

1.  Introducir dos tubos Eppendorf estériles en hielo marcar uno como +ADN y el otro como -ADN

[pic 5]

1.  Añadir a cada tubo 40 μl de la suspensión de células competentes

1. Añadir a la suspensión marcada como +ADN 2 μl de solución de plásmido pGEM-T (la otra suspensión se somete a la misma manipulación para verificar al final del experimento que las células competentes son sensibles al antibiótico).

[pic 6]

1. Incubar ambas suspensiones en hielo durante 2 minutos

[pic 7]

1. Colocar ambas suspensiones en un baño a 42ºC durante no mas de 60 segundos. Hemos sometido a las células a un choque térmico durante el cual se debe producir la entrada del ADN plasmídico en las células competentes.

[pic 8]

1. Enfriar las suspensiones en hielo durante 2 minutos

[pic 9]

1. Añadir 400 μl de caldo LB a ambos tubos

[pic 10]

1. Incubar a 37ºC en agitación a 150 rpm durante 1 hora. Durante este periodo se reinicia la actividad metabólica y se expresarán los genes introducidos.

1. Detección de transformantes

[pic 11]

1. Diseminar 50 μl de la suspensión de células transformadas (ADN+) en ambos medios de cultivo LB agar selectivo (con ampicilina) y no selectivo.

[pic 12]

1. Diseminar 50 μl de la suspensión de células no transformadas (ADN-) en ambos medios de cultivo LB agar selectivo (con ampicilina) y no selectivo.

[pic 13]

1. Incubar las placas a 37ºC durante 24 horas

III. Resultados

[pic 14]

La aparición de colonias en el medio selectivo Agar LB con ampicilina indica las células que han adquirido resistencia a la ampicilina por transformación con el plásmido de resistencia