Determinación De Biomasa

DETERMINACION DE BIOMASA

I.- INTRODUCCION.

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables.

Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer) o métodos como la espectrofotometría.

II.- OBJETIVOS.

• Determinar células viables por métodos directos e indirectos.

• Relacionar métodos de determinación de biomasa.

• Comprender el uso y el fundamento de los métodos para determinar biomasa.

III.- FUNDAMENTO TEORICO.

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.

Métodos directos:

• Recuento del número de células en una cámara Thoma

• Peso seco celular

• Determinación de nitrógeno o de proteínas totales

• Determinación de DNA

Métodos indirectos:

• Recuento de colonias en placa

• Recuento sobre filtro de membrana

• Consumo de oxígeno

• Liberación de dióxido de carbono

• Concentración de un enzima constitutivo

• Decoloración de un colorante

• Incorporación de precursores radiactivos

• Medida de la turbidez

CAMARA DE NEUBAUER

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Fig. 1

Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será:

Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

Fig. 2

En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Fig. 3 cámara de Neubauer doble

ESPECTROFOTOMETRÍA

Es la medida de la cantidad de energía radiante absorbida por las moléculas a longitudes de onda específicas.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas.

Espectrofotómetro

 El espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en función de la longitud de onda

Métodos Espectroscópicos

 Los métodos espectroscópicos de análisis se basan en la medida de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia.

 Los métodos de emisión utilizan la radiación emitida cuando un soluto es excitado por energía térmica, eléctrica, o energía radiante.

 Los métodos de absorción, por el contrario, están basados en la disminución de la potencia (o atenuación) de la radiación electromagnética como consecuencia de la absorción que se produce en su interacción con el soluto.

 Los métodos de absorción poseen la considerable ventaja de producir poca o ninguna alteración en el sistema estudiado.

 Los métodos espectroscópicos se consideran como una de las mejores y más utilizadas técnicas instrumentales a disposición del científico, para la adquisición de información tanto cuantitativa como cualitativa.

Transmitancia

 es la fracción de radiación insidente transmitida por la solución, por lo general la Transmitancia se expresa en porcentaje. Esta definida por la ecuación:

T= P / P0 T= 10-A %T= T * 100

Absorbancia

 Es la medida de la energía radiante que es absorbida por un material o una superficie como función de la longitud de onda de dicha energía. A diferencia de la Transmitancia, la absorbancia de una solución que aumenta la atenuación del haz esta definida por la ecuación:

A= Log P0 / P A= Log 1/T

Fig. 4

IV.- METODOS.

 METODO DE NEUBAUER.

1) Se realiza diluciones 10-1,10-2,10-3,10-4 con levadura panadera granulada (sacharomyces cerviceae) respectivamente.

2) Se toma las diluciones 10-3,10-4 y se colocan muestras en la cámara de neubauer.

3) Se procede al conteo de células en el microscopio óptico a 10X (visión general) y 40X (conteo de células en cada cuadrante).

∑CUADRANTES = IC + IIC + IIIC + IVC = Promedio x 1000 = Cel/ml/Diluc.

4 Dilución

IC = Primer cuadrante.

C1= Celda uno.

 METODO DE ESPECTOFOTOMETRIA.

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