Aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de alimentos

Aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de alimentos

Objetivos

• Determinar la presencia de Listeria monocytogenes utilizando protocolos de aislamiento tradicionales a partir de leche no pasteurizada (cruda)
• Identificar bioquímicamente cepas Listeria monocytogenes u otro microorganismo presuntivo

[pic 1]

[pic 2]

[pic 3]

[pic 4]

[pic 5][pic 6]

[pic 7]

[pic 8]

[pic 9]

[pic 10]

[pic 11]

[pic 12]

[pic 13]

[pic 14]

:[pic 15]

[pic 16]

[pic 17]

[pic 18]

[pic 19]

[pic 20]

[pic 21]

[pic 22]

[pic 23]

RESULTADOS Y ANALISIS

El caldo Half Fraser Broth es un caldo utilizado para el enriquecimiento de Listeria monocytogenes, El medio está destinado para el aislamiento de Listeria spp. A partir de muestras de alimentos y medioambientales cuando se usa como el medio de enriquecimiento (Fraser JA y Sperber WH (1988) J.

[pic 24]

El medio originalmente es de color amarillo y no se notó un viraje a color negro el cual presentan generalmente las cepas de Listeria spp., debido a que la bacteria presente no hidrolizo el glúcido esculina en glucosa y esculetina, la esculetina reacciona con los iones férricos del citrato férrico de amonio presente en el medio para tornarlo de color negro o gris. El medio contiene ácido nalidíxico y clorhidrato de acriflavina para ayudar en la recuperación de células estresadas y también sirven junto al cloruro de litio como componentes selectivos inhibiendo el crecimiento de la flora Gram positiva en el medio.

Después de haber realizado la lectura presuntiva del caldo Half Fraser Broth se procedió a realizar siembra en agar palcam a partir de un inoculo de este caldo,

[pic 25]

En este medio se pudo observar un crecimiento de las colonias aisladas de color verde-grisáceo con halos marrón-negro debido a que el microrganismo presente en el medio de cultivo hidroliza el glucósido esculina formándose glucosa y esculetina; esta última, con el hierro trivalente y el crecimiento de colonias próximas produce las características anteriores en el medio. La selectividad de este medio se debe a las sustancias inhibidoras del crecimiento tales como polimixinas B-sulfatos, acriflavina, cloruro de litio y ceftacidina por estas razón pudimos percibir el crecimiento de colonias características de L. monocytogenes ya que este medio de cultivo es selectivo para este tipo de microorganismo, sin embargo este medio contiene manitol donde para este microorganismo fue negativo ósea que no degrada manitol.

A partir del medio de cultivo palcam se tomó una colonia representativa de Listeria spp. y se sembró por agotamiento en un medio nutritivo para tenerla axenica y poder realizarle las pruebas bioquímicas respectivas

PRUEBA DE GRAM O TINCION DE GRAM

[pic 26]

En la tinción de Gram se pudo observar la presencia de cocos con una tonalidad morada lo que nos indica que son positivos para esta prueba, es decir se obtuvieron cocos Gram positivos.

PRUEBA DE CATALAZA

[pic 27]

Al agregar peróxido de hidrogeno a la cepa se presentó un burbujeo indicando que el peróxido de hidrogeno fue degradado en agua y oxigeno esto se da gracias a la presencia de la enzima catalasa presente en las células de la cepa analizada.

PRUEBA DE OXIDASA

[pic 28]

Se agregó un inóculo de la bacteria estudiada a una tira especial para determinar si la bacteria posee la enzima citocromooxidasa, el resultado fue negativo ya que en la tira no se presentó un cambio de color.

PRUEBA PARA FERMENTACION DE AZUCARES Y [pic 29]

Para realizar esta prueba se utilizó el agar TSI el cual está formado por glucosa, lactosa, sacarosa y ácido sulfhídrico.

[pic 30]

El resultado de la prueba fue  .gas +[pic 31]

El medio inicialmente era de color rojo y se evidencio un cambio de color en la parte inferior, media y sobre la estría realizada indicando la degradación de glucosa, lactosa y sacarosa respectivamente, la tonalidad negra que presento el tubo se debe a que la bacteria tiene la capacidad de reducir el ácido sulfhídrico y también se encontró que produce gas cuando fermenta la glucosa.

Para comprobar si la bacteria fermentaba los azucares manitol, ramnosa y xilosa con o sin producción de gas se realizó una prueba con cada azúcar en tubos diferentes y en cada tubo había una campana de Durham.

[pic 32]

En el tubo de la derecha se evidencio la fermentación del azúcar manitol con producción de gas siendo la bacteria positiva para manitol, en el tubo del centro el medio viro un poco de color pero no se evidencio un cambio total ni producción de gas por lo tanto se toma como negativo para la fermentación de ramnosa y él tubo de la izquierda que contenía xilosa evidencio un cambio leve en el color del medio y produjo de gas por lo tanto se toma como un posible resultado positivo para la fermentación de xilosa.

La detección de L. monocytogenes en leche cruda constituye un peligro potencial para el consumidor. Su presencia demuestra la ubicuidad del patógeno y su capacidad para multiplicarse a bajas temperaturas. Un estudio realizado en la Universidad Austral de Chile con muestras de leche cruda se han encontrado diferentes tipos de bacterias resultados de los análisis bacteriológicos indicaron que, de las 50 muestras de leche cruda, 11 (un 22%) fueron positivas a la presencia de L. monocytogenes y en una (un 2%), se aisló L. ivanovii , sin detectarse otras especies del género Listeria. La frecuencia de presentación de L. monocytogenes encontrada fue superior a la de países europeos, donde se ha aislado a L. monocytogenes en un porcentaje que varía entre 0% y 6,0 %, con excepción de España, país en el cual se ha encontrado la bacteria en leche cruda en un rango que varía entre un 3,6% y un 45%. En Canadá y EE.UU. de N.A. las cifras de detección son similares a los países europeos y varían entre un 0% y 12%. En Méjico en cambio, no aislaron  L. monocytogenes a partir de leche cruda, identificando sin embargo otras especies del mismo género (RENATE SCHÖBITZ et al.2001), en otros estudios también se ha encontrado la presencia de Staphylococcus en la Orinoquia colombiana Se tamizaron 29.451 estudios microbiológicos, de los cuales, 26,7% fueron positivos. Se identificaron 1.722 (21,9%) como Gram positivos y, de éstos, 56,7% se tipificaron como S. aureus por su patrón bioquímico, de los cuales, 92,3% fueron sujetos del estudio, a quienes se les registró la CIM (José F Faria, Aleída Garcia, 2010).

...