ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LIPASA

[pic 1][pic 2]

[pic 3]

1. PRÁCTICA DE LABORATORIO NOMBRE:

1. OBJETIVOS

General

Describir las principales características de la actividad, los métodos de visualización de la lipasa y adquirir experiencia en el uso de enzimas en métodos de laboratorio.

Específico:

• promover la capacidad de los estudiantes para correlacionar datos experimentales y computacionales.
• capacitar al estudiante en el uso de bases de datos y el uso de software en línea.
• analice las interacciones ligando-proteína utilizando una visualización sencilla de los resultados del acoplamiento molecular.

1. CONCEPTOS INTRODUCTORIOS

Las lipasas, conocidas como glicerol hidrolasas (EC 3.1.1.3), son enzimas que tienen el papel biológico de hidrolizar los ésteres de glicerol ingeridos de fuentes dietéticas. Además, se han utilizado para fines industriales, como textiles, procesamiento de pulpa de papel, cosméticos, productos farmacéuticos, tratamiento de desechos y producción de biocombustibles. El estudio de las lipasas implica la catálisis de múltiples reacciones, como la esterificación, transesterificación, alcohólisis y acidólisis, con aplicación en entornos educativos.

Las lipasas están ampliamente distribuidas en la naturaleza, ya que se encuentran en una variedad de organismos (es decir, de

microorganismos a plantas y animales). Una característica común de estas proteínas es la presencia de un sitio activo conservado. Este sitio consta de una tríada catalítica formada por un residuo nucleofílico (Ser, Cys o Asp), un residuo de ácido catalítico (Asp o Glu) e His. Además, las lipasas son hidrolasas de serina ya que

contienen serina como residuo nucleofílico.

Por otro lado, el estudio de las interacciones enzima-sustrato y de los inhibidores enzimáticos es un tema primordial para comprender el reconocimiento molecular, la función de las proteínas y el desarrollo de nuevos fármacos. Por lo tanto, los métodos de visualización y acoplamiento molecular son herramientas relevantes para estas áreas. Actualmente, existen numerosos métodos in silico aplicables a fines educativos. Estos métodos han sido explorados previamente y han demostrado ser útiles en diferentes campos de la pedagogía bioquímica, junto con el uso de enfoques tecnológicos, como simulación, visualización y herramientas en línea, entre otros.

1. TEMAS PREVIOS A CONSULTAR

1. prepare una breve reseña sobre la estructura, la función y el papel biológico de la lipasa, y los métodos para evaluar la actividad enzimática.
2. Consulte las bases de datos para buscar información sobre el mecanismo de la enzima. (sugirió :https://proteopedia.org/wiki/index.php/Lipasa)
3. Compruebe la estructura de la lipasa utilizando la base de datos PDB. (código PDB: 1ETH y 1CRL) y subrayar las principales características estructurales de cada uno.
4. Descargue el software gratuito. quimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Asegúrese de utilizar la plataforma adecuada según su computadora.
5. ¿Qué significa "acoplamiento"? ¿Cuáles son las principales características del acoplamiento en aplicaciones computacionales biomoleculares?

1. MATERIALES, EQUIPOS Y QUÍMICOS

1. PROCEDIMIENTO

1. extracto de enzima

Pesar 100 mg de lipasa de páncreas porcino (LPP), tipo II (30-90 U/mg utilizando triacetina) y añadir 10,0 mL de tampón. Agitar suavemente hasta dispersión uniforme, centrifugar el extracto resultante a 7000 rpm durante 10 min. Recuperar la enzima del sobrenadante. El extracto se puede almacenar en un baño de hielo.

1. Actividad enzimática

Las soluciones de prueba se indican en la tabla 1. LPP (extracto de lipasa) y el tampón se mezclan y luego se vierten en la cubeta del espectrofotómetro para alcanzar el equilibrio térmico durante 5 min. La actividad enzimática comienza inmediatamente que se agrega el NPP. Registre la absorbancia a 405 nm, cada 30 segundos durante 15 minutos. La tasa inicial se puede obtener de la curva de progreso de diferentes maneras, es decir, utilizando el modelo de Michaelis-Menten, o la pendiente de la parte lineal inicial).

Tabla 1:Prueba de actividad enzimática

1. Curva de calibración

La solución de 4-nitrofenol en etanol es 0,1 M. Esta solución se diluye en el tampón en el rango de 1-4 mM para medirse espectrofotométricamente a 405 nm. Prepare una curva de calibración. En la figura 1 se muestra una curva de ejemplo.

[pic 4]

Figura 1. Curva de calibración de NP

1. Modelos Computacionales.

La estructura cristalina de la lipasa (entrada PDB 1ETH; entradas adicionales de lipasa incluidas 1CRL, 1CVL, DTE, 2QXU y 1HLG) se puede recuperar del Protein Data Bank (http://www.pdb.org/).

...