Clase Antimicrobianos naturales

Resumen

Este estudio se llevó a cabo para determinar la composición química y la capacidad antioxidante de Echinophora platyloba DC. Aceite esencial y su potencia antimicrobiana contra Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157: H7, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida tropicalis mu, Rhodotorula rubicula. El aceite esencial fue analizado por GC y GC-MS; y evaluado por su actividad antioxidante y antimicrobiana (individualmente o en combinación con quitosano, nisina, monolaurina o anfotericina B). Se caracterizaron treinta y tres componentes que representan el 95,69% de la composición total del aceite en el que timol, trans-ocimeno, carvacrol y (E) -sesqui-lavandulol fueron los constituyentes principales. El aceite exhibió una alta captación (IC50: 49.7 ± 2.3 μg / mL) y una actividad antioxidante relativa (RAA%: 85.21 ± 0.4) en los radicales 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo y ensayos de blanqueo con ácido β-caroteno / linoleico, respectivamente. El aceite mostró actividad antimicrobiana contra L. monocytogenes, B. cereus, B. subtilis, S. aureus, S. typhimurium, E. coli O157: H7, P. aeruginosa, C. albicans, C. tropicalis, R. Rubra y R. mucilaginosa. Además, R. mucilaginosa y P. aeruginosa fueron los organismos más susceptibles y más resistentes, respectivamente. Con respecto a los datos del tablero de ajedrez, 47 índices de concentración inhibitoria fraccional (FICI) (≤0,5) indicaron sinérgico, mientras que 7 FICI (> 0,5 a 1) indicaron efecto aditivo. En consecuencia, E. platyloba DC. El aceite esencial podría usarse como un antioxidante natural y una sustancia antimicrobiana recomendada para la conservación de alimentos.

Introduccion

Hoy en día, existe un creciente interés en las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de los aceites esenciales en todo el mundo (Ennajar y otros 2009; Min y Oh 2009; Jia y otros 2010; Saei-Dehkordi y otros 2010; Rohani y otros 2011; SaeiDehkordi y otros 2012) . Es bien sabido que la aplicación de antioxidantes sintéticos como el hidroxianisol butilado, el hidroxitolueno butilado y la butilhidroquinona en los alimentos podría provocar daños hepáticos, toxicidad y cáncer en animales de laboratorio (Saei-Dehkordi y otros 2010). El género Echinophora pertenece a la familia Umbelliferae y comprende más de 10 especies, de las cuales 4 especies se cultivan de forma silvestre en Irán. Echinophora platyloba DC. (con el nombre persa Khosharizeh o Khosharouzeh) es una de las especies más fascinantes y es bien conocida por su propiedad aromática favorable. Se utiliza como condimento y agente anti-moho en coliflor en escabeche, pepinillo y queso nativo, especialmente en las provincias de Chaharmahal y Bakhtiari (Asghari y otros 2003; Avijgan y otros 2010).

La nisina ha sido considerada por la Organización Mundial de la Salud como la única bacteriocina conservante aprobada en la industria alimentaria (Periago y Moezelaar 2001). La monolaurina es un derivado de ácidos grasos que se utiliza como conservante natural de alimentos (Blaszyk y Holley 1998). El quitosano mostró una fuerte actividad antibacteriana en bacterias y hongos gram positivos, mientras que las bacterias gram negativas fueron menos susceptibles. El quitosano está aprobado por la FDA de los Estados Unidos como una sustancia generalmente reconocida como segura (GRAS) (Giatrakou y otros 2010). Hasta donde sabemos, no se ha realizado ningún trabajo exhaustivo sobre la actividad antioxidante o animicrobiana del aceite esencial de E. platyloba DC. Sólo hay datos limitados sobre la composición química de este aceite esencial. Además, no se han publicado datos sobre la composición química del aceite derivado del suroeste de Irán como una de las regiones geográficamente más importantes del crecimiento de la planta. Por consiguiente, este estudio tenía por objeto evaluar la composición química y la capacidad antioxidante del aceite esencial de E. platyloba DC. y su potencia antimicrobiana contra los microorganismos relacionados con los alimentos. Además, se evaluaron los efectos antimicrobianos combinados in vitro del aceite esencial de E. platyloba DC. con cada uno de los antimicrobianos (nisina, monolaurina, quitosano y anfotericina B) contra un amplio espectro de patógenos transmitidos por los alimentos y organismos de deterioro.

Material y métodos

Productos químicos y equipos

Los radicales 1,1-Difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), β-caroteno, ácido linoleico, butilhidroxitolueno (BHT), ácido ascórbico, quitosano de bajo peso molecular, anfotericina B y monolaurina (pureza ≥99%) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., U.S.A.). El etanol de grado analítico, el dimetilsulfóxido (DMSO), el cloroformo de grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), el sulfato de sodio anhidro, el ácido acético, el ácido clorhídrico, el Tween 40, y todos los medios de cultivo se compraron a Merck (Darmstadt, Alemania). El Nisin se obtuvo de Nisaplin (Aplin & Barrett, Trowbridge, Reino Unido). Los principales equipos utilizados fueron el cromatógrafo de gases Agilent HP-6890 (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU.), el cromatógrafo de gases Agilent HP-6890 equipado con un detector selectivo de masas Agilent HP-5973 (Agilent Technologies), un espectrofotómetro UV-visible (UV-1700, Shimadzu Corp.., Kyoto,Japón), un aparato de hidrodestilación de Clevenger (Pars Ltd., Teherán, Irán), y un evaporador rotativo de vacío (Heidolph, Laborota 4000,Schwabach, Alemania).

Material vegetal

La planta silvestre de Chaharmahal y la provincia de Bakhtiari, situada en el suroeste del Irán, se recogió en mayo de 2010. Las especies de las muestras fueron identificadas y confirmadas en el Herbario del Inst. de Plantas Medicinales del Departamento de Farmacognosia y Farmacéutica, Karaj, Irán.

Aislamiento del aceite volátil

Las partes aéreas de la planta se secaron en un horno equipado con circulación de aire caliente. Cien gramos del material secado al aire fueron molidos y pulverizados. El polvo se sometió a una hidrodestilación durante 3 h utilizando un sistema tipo Clevenger. El aceite se mantuvo de 2 a 4 ◦C en un frasco marrón sellado.

Análisis de la composición del aceite

Para obtener el programa de temperatura de columna más apropiado para la completa separación de los componentes, el aceite esencial se inyectó en el cromatógrafo de gases (GC). Se determinó el porcentaje de componentes del aceite y los índices de retención de cada componente. Los análisis de GC se realizaron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent HP-6890 equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna HP-5MS (30 m × 0,25 mm, espesor de la película 0,25 μm). La temperatura del horno se mantuvo a 50 ◦C durante 3 min, luego elevado a 250 ◦C por un gradiente de 3 ◦C/min. El FID y el inyector las temperaturas fueron de 290 ◦C y 220 ◦C, respectivamente. El helio era el gas portador a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Datos cuantitativos se obtuvieron electrónicamente del porcentaje del área de detección datos sin considerar los factores de corrección. La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) se realizó en un cromatógrafo de gases Agilent HP-6890 acoplado a un espectrómetro de masas Agilent HP-5973. La energía de ionización del espectrómetro de masas en el modo de impacto de electrones fue igual a 70 eV. Las condiciones cromatográficas eran idénticas a las mencionadas para el análisis de GC. Los componentes individuales se identificaron y confirmaron después de calcular los índices de kovats (KI) de los componentes en relación con sus tiempos de retención de una serie de n-alcanos y compararlos y sus espectros de masas con los de muestras auténticas o con los datos disponibles de la biblioteca del sistema GC-MS (WILEY 2001 software de datos) así como los espectros de masa publicados (Adams 2001).

Actividad antioxidante

Ensayo DPPH. La capacidad del aceite esencial para eliminar los radicales DPPH se determinó de acuerdo con el método descrito en nuestro estudio anterior (Saei-Dehkordi y otros 2010). La actividad antioxidante del aceite se comparó con la actividad de antioxidantes conocidos como el butilhidroxitolueno y el ácido ascórbico como controles positivos. Los datos obtenidos se expresaron como IC50 (μg/mL). Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

ensayo de blanqueo de β-aroteno/ácido linoleico. La capacidad antioxidante del aceite esencial de E. platyloba DC. se determinó según Miller (1971). Brevemente, 0,5 mg del β-caroteno se disolvió en 1 mL de cloroformo de grado HPLC (CHCl3). Luego, se añadieron 25 μL de ácido linoleico y 200 mg de Tween 40. Se utilizó un evaporador rotativo al vacío para evaporar el cloroformo. Después de la eliminación completa del cloroformo, se añadieron 100 mL de agua destilada saturada de oxígeno. Entonces 2.5 mL de la reacción la mezcla se transfirió al tubo de ensayo y se añadió a la emulsión 350 μL del aceite (concentración: 2 mg/mL). A continuación, la muestra se sometió a incubación a temperatura ambiente durante 48 h. Se repitió el mismo procedimiento con el control positivo (BHT) y un blanco que contenía sólo 350 μL de etanol. Finalmente, se leyó la absorbancia a 490 nm. Las actividades antioxidantes relativas (RAA) del aceite esencial de E. platyloba DC. en porcentaje fueron calculado con la siguiente ecuación:

RAA% = absorbencia del aceite/absorbencia de BHT (control)

× 100

Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Actividad antimicrobiana

Microorganismos. Se estudió la actividad antimicrobiana del aceite esencial utilizando los siguientes organismos: bacterias positivas de 4 gramos, a saber, Listeria monocytogenes ATCC 19118, Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 10907 y Staphylococcus aureus ATCC 2228; bacterias negativas de 3 gramos, a saber, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli O157: H7 ATCC 43895, y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; y 4 levaduras de deterioro de alimentos, a saber, Candida albicans ATCC 10231, Candida tropicalis ATCC 13801, Rhodotorula rubra PTCC 5076, y Rhodotorula mucilaginosa ATCC 2503. Los organismos utilizados en los ensayos microbiológicos se obtuvieron de la colección de cultivos del Laboratorio de Higiene y Control de Calidad de los Alimentos de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Univ. de Shahrekord (Irán). Para comprobar la pureza, las bacterias se cultivaron en agar de soja tríptico (TSA) y se incubaron en 37 ◦C durante la noche, mientras que las levaduras se inocularon en agar de dextrosa de sabouraud (SDA) y se incubaron en 30 ◦C durante 48 h. Las cepas se suspendieron en TSA y SDA para obtener una densidad final de aproximadamente 106 UFC/mL, y se confirmaron mediante recuentos viables.

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