Determinación de proteínas por el método de Kunitz

Químico Bacteriólogo Parasitólogo
Pablo Escobar Cruz
Métodos de Análisis
5QV1
Rivas Farías Arturo [pic 1][pic 2]

Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas por el método de Kunitz.

Objetivos:

• Determinar la eficiencia de las tres enzimas empleadas en la práctica (bromelaína, papaína y tripsina)
• Elaborar una curva estándar de actividad enzimática.

Fundamento:

El método de Kunitz se emplea para la determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas, el cual se basa en medir la cantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis de la caseína por proteínas proteolíticas (bromelaína y papaína) aprovechando la capacidad, de ciertos de ellos y puedan absorber selectivamente a 280 nm.

Resultados y Cálculos:

Tabla 1. Actividad Enzimática de la Tripsina para la elaboración de la curva estándar con resultados experimentales.

Tabla 2. Actividad Enzimática de la Tripsina para la elaboración de la curva estándar con resultados proporcionados por el profesor encargado.

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Figura 1. Curva estándar elaborada en base a los datos proporcionados por el profesor, indicando la relación de la concentración de la tripsina con la absorbancia a 280 nm.

Para calcular las unidades trípticas se emplea la siguiente formula:

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Este resultado es para 1 mg de tripsina si queremos calcular para cada concentración se establece la siguiente formula:

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Se realiza esta misma operación para cada concentración de la curva estándar para obtener las unidades trípticas correspondientes:

Tabla 3. Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.

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Figura 2. Curva estándar elaborada en base a los datos proporcionados por el profesor, indicando la relación de las Unidades Tripticas con absorbancia a 280 nm.

Tabla 4. Absorbancias específicas para cada enzima problema empleada en el método.

De los filtrados de obtuvieron los siguientes volúmenes:
filtrado de papaya: 34 mL
filtrado de piña: 35.5 mL

Para obtener las unidades trípticas de la papaína y de la bromelaína se establece lo siguiente:
Sí por cada 25 g de papaya se obtuvo 34 mL se realiza el cociente entre ambos para obtener g/mL así mismo multiplicar por el factor de dilución más concentrado siendo 1:2 y se obtiene 0.36765 g/mL, y para obtener las unidades trípticas para la papaína se sustituye en la ecuación de la gráfica de la figura 2 despejando la literal x (Unidades Trípticas):

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Estableciendo la igual como: “Sí 0.36765 g/mL me producen 0.00187 UT, ¿Cuántas UT me producirán 1 g de esta enzima?”

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