Blastocystis spp

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INTRODUCCIÓN

Blastocystis spp. es un microorganismo unicelular perteneciente al reino Chromista y es frecuentemente hallado en el tracto gastrointestinal humano.

Es uno de los microorganismos hallados con mayor frecuencia en muestras de heces; sin embargo, aún existen ciertas dudas o controversias de su taxonomía, morfología, ciclo vital y patogenicidad.

El análisis genético de Blastocystis ha mostrado ser una herramienta útil en el esclarecimiento de tales controversias, en especial aquellas respecto de su potencial rol como causante de enfermedades diarreicas en seres humanos y para identificar las cepas infectantes que afectan a estos y cuales a los animales.

MARCO TEÓRICO

Blastocystis spp. es un parásito polimorfo y anaerobio que se caracteriza por tener 4 morfotipos representativos: vacuolar, granular, ameboide y quiste.

Se considera un problema de salud pública, también es catalogado como un protozoo de distribución mundial, se asocia en un 60% en zonas tropicales y subtropicales y más frecuentemente en países en vía de desarrollo y asociado a poblaciones con malas condiciones de saneamiento, pobreza y malos hábitos higiénicos, diseminándose en el consumo de alimentos y aguas contaminadas con heces, convirtiéndose en un foco de infección.

Infecta comúnmente a los humanos, aunque puede encontrarse en animales como aves y mamíferos; en los cuales habita principalmente en el tracto gastrointestinal.  

Tanto los seres humanos como los animales son infectados por quistes fecales que al ingresar al intestino grueso cambian su forma quística a vacuolar.

Se considera que uno de los principales focos infecciosos está constituido por los animales, especialmente aquellos con los que el ser humano tiene contacto frecuente. A pesar de estas evidencias, el ciclo biológico de este agente no es claro, aunque en la literatura han sido descritos los ciclos infectivo y autoinfectivo.

La vía de transmisión de este parásito es fecal - oral. El ciclo comienza cuando el hospedero, ingiere alimentos o agua contaminada con quistes infectantes de pared gruesa de Blastocystis spp. Al pasar por el tracto digestivo, se desenquistan en el estómago, gracias a la acción de las enzimas y de los ácidos presentes en el mismo.

El parasito presenta distintas cepas, las cuales varían genéticamente, pero también son especificas en el hospedero (hombre o animal) y si son intermediarios o definitivos. Hasta ahora, se han identificado 17 subtipos, de los cuales ST1 a ST8 colonizan/infectan a humanos y otros hospederos, ST9 solo coloniza a humanos, y ST10 - ST17 se han identificado únicamente en otros hospederos.

El ser humano se infecta con mayor frecuencia de el subtipo ST3, pero también se identifican con regularidad infecciones con los subtipos ST1, ST2 y ST4; los restantes causan infección esporádica.

Para el diagnostico de esta parasitosis se emplean CPS directo en fresco, microscopia de luz óptica. Otras técnicas que utilizadas son tinciones como tricrómica, Lugol, o acido alcohol resistente, pero estas técnicas presentan la desventaja en que no se puede diferenciar los subtipos de Blastocystis spp., de ahí la importancia de emplear las técnicas moleculares ya que pueden ofrecer resultados más confiables y precisos debido a la variabilidad genética de este microorganismo.

OBJETIVO

Identificar la presencia o ausencia del parasito Blastocystis spp. en muestras de heces fecales, mediante técnicas de Biología Molecular.

METODOLOGÍA

1. Extracción

Se empleó el método de extracción Power Fecal DNA Isolation Kit, de la marca comercial MO BIO Laboratories, Inc.

Se utilizaron los siguientes equipos de laboratorio y reactivos contenidos en el kit.

1. En un tubo de centrífuga de polipropileno, colocamos solución PBS y con ayuda de un aplicador una cantidad de la muestra, mezclamos y centrifugamos a 3000 rpm durante 6 minutos.
2. En el tubo de lavado (Collection tubes) adicionamos 0.25 g de heces, (tomados después de centrifugar).
3. Adicionamos 750 µl de solución de perlas (Bead solution) al tubo de lavado y vortexeamos suavemente.
4. Verificamos que la solución C1 no se encontrara precipitada, si hubiera sido así debíamos calentarla a 60°C hasta que esta se disolviera antes de su uso.
5. Adicionamos a la muestra 60 µl de la solución C1 e invertimos 7 veces.
6. Calentamos los tubos a 65°C durante 10 minutos.
7. Vortexeamos a velocidad máxima durante 10 minutos.
8. Posteriormente centrifugamos a 13000 rpm durante 1 minuto.
9. Transferimos el sobrenadante obtenido a un tubo limpio de 2ml.
10. Adicionamos 250µl de solución C2, vortexeamos brevemente para mezclar e incubamos a 4°C durante 5 minutos.
11. Después a centrifugar los tubos a 13000 rpm por 1 minuto.
12. Evitando el botón, transferimos 600 µl del sobrenadante a un tubo de 2ml limpio.
13. Posterior a esto se adiciono 200µl de solución C3 y vortexeamos brevemente, e incubamos a 4°C durante 5 minutos.
14. Centrifugamos a 1200 rpm durante 1 minuto.
15. Evitando el botón transferimos el sobrenadante a un tubo limpio de 2ml. Cuidando de no transferir más de 750µl en este paso.
16. Se agito la solución C4 antes de su uso. Adicionar 1200 µl de solución C4 en el sobrenadante y vortexeamos por 5 segundos.
17. Cargamos 650 µl del sobrenadante en los filtros giratorios y centrifugamos a 1300 rpm por 1 minuto. Se descartó el fluido completamente y repetimos hasta que todo el sobrenadante se cargó en los filtros. (Un total de 3 cargas para cada muestra son requeridas en el proceso)
18. Se adicionaron 500 µl de solución C5 y se centrifugo por 1 minuto a 12000 rpm.
19. Descartamos el fluido.
20. Nuevamente centrifugamos por 1 minuto a 13000 rpm.
21. De manera muy cuidadosa situamos el filtro giratorio en un tubo limpio de 2 µl evitando salpicar.
22. Adicionamos 100 µl de solución C6 en el centro de la parte blanca del filtro.
23. Como último paso de la extracción centrifugamos a 13000 rpm durante 1 minuto y se descartaron los filtros giratorios. El DNA está listo para cualquier aplicación y por lo mencionado en el inserto del kit era recomendable conservar el DNA a temperatura de -20° a -80°.

I.I Etapas de la extracción

I.I.I Preparación de la muestra y lisis celular

Como se mencionó brevemente, la muestra fue centrifugada y se coloco en un tubo del lavado añadiendo Bead Solution cuya función es ayudar a disolver y dispersar las partículas de la muestra.

Posteriormente se adiciono la solución C1, esta contiene SDS y otros agentes de disrupción que ayudan a la lisis celular. SDS es un detergente aniónico que descompone los ácidos grasos y los lípidos asociados con la membrana celular de varios organismos. Por consiguiente, calentamos los tubos a 65°C esto porque las muestras fecales contienen una matriz compleja de polisacáridos, lípidos, sales y células., al calentar la muestra aumentamos la velocidad de reacción entre el tampón de lisis agregado (Sol. C1) y estas sustancias y ayuda a la lisis celular. Como paso final de esta etapa vortexeamos, esto porque al agitar existe una colisión de las perlas de la solución con las células microbianas y esto hará que las células se abran.

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