Cuantificacion por espectrofotometris

Cuantificación por Espectrofotometría

INTRODUCCIÓN:

La Espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración, se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distintas naturalezas.

Estas moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna, esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción la cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto, para esta medición se estableció la Ley de Beer que establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía absorbida por ella.

OBJETIVOS:

• Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína.
• Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer.
• Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros.

MATERIALES:

• Reactivos:        Estándar de BSA (albúmina de suero de bovino) 100 mg/ml

• Reactivo de Bradford.

• Muestras Biológicas:   Extracto proteico (muestra de leche descremada industrial).

• Materiales/ equipos:        Tubos.

• Pipetas de 5 ml.
• Vortex.
• Gradilla para tubos de ensayo.
• Espectrofotómetro/ cubetas.

METODO EXPERIMENTAL:

A.) Construcción de la curva de calibración:

Para la construcción de la curva de calibración se prepararon 5 tubos eppendorf de 1,5 ml enumerados del 1 al 5 con mezclas de albumina y agua en distintas proporciones como se indica a continuación:

• Tubo 1: 200 microlitros de albumina, 700 microlitros de agua
• Tubo 2: 100 microlitros de albumina, 800 microlitros de agua
• Tubo 3: 40 microlitros de albumina, 860 microlitros de agua
• Tubo 4: 20 microlitros de albumina, 880 microlitros de agua
• Tubo 5: 0 microlitros de albumina, 900 microlitros de agua

Posteriormente agregada la albumina y el agua se le añadió 100 microlitros de Biuret a cada tubo eppendfor los cuales fueron agitados por un momento para que se mezclaran de una mejor forma y dejados en reposo durante 5 minutos.

Una vez transcurrido el tiempo de espera se midió la D.O. (Densidad Óptica) en el Espectrofotómetro a 595nm, comenzando desde la dilución más diluida a la más concentrada.

Conseguidos los resultados se obtuvo la absorbancia de cada tubo procediendo luego a la construcción de la curva de calibración  a 595nm versus la concentración estándar de cada uno de ellos.

B.) Cálculo de la concentración de proteínas en su muestra: Leche.

Se preparó la muestra tomando 20 microlitros de leche, combinándolas con 2.000 microlitros de agua destilada, luego se le agregó 100 microlitros de Biuret, se mezcló y esperó por al menos 5 minutos para que se formase completamente el color, luego se procedió a medir la D.O (Densidad Óptica) a 595 nm y se calculó el coeficiente de extinción molar por interpelación directa del gráfico y a partir de la ecuación de la recta.

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