Espectrofotometría y detección de carbohidratos

Informe Laboratorio de Bioquímica

Espectrofotometría y detección de carbohidratos

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Profesor: Felipe Herbage Saez        

Ayudante: Camila Hernandez S.         

Fecha de experiencia:25/04/2017         

  9 /05/2017        

            Fecha de entrega:       17/05/2017        

                                    Integrantes:   Eduardo Arqueros        

Andrea Bravo                

Denisse Mellado        

Karina Olea                

Índice

Índice        1

Introducción        2

Objetivos        3

Objetivos principales        3

Objetivos específicos        3

Materiales y Metodología        3

Materiales        3

Metodología        4

Espectrofotometría        4

Detección de Carbohidratos        5

Prueba de Dubois: determinación de azúcares totales.        5

Prueba de Miller: determinación de azúcares reductores.        5

Resultados        6

Espectrofotometría        6

Detección de Carbohidratos        7

Método de Dubois        7

Método de Miller        7

Discusión        8

Espectrofotometría        8

Prueba de Miller        11

Prueba de Dubois        12

Conclusión        13

Referencias        14

Introducción

Junto con el descubrimiento de la química, aumentó la curiosidad del hombre por conocer los compuestos que forman parte de todo el espacio y que hacen posible la vida misma, llevando al hallazgo de los elementos químicos y con estos a los compuestos, lo que  dirige  al ser humano a hacerse cada vez más cuestionamientos, uno de estos es la manera de conocer la concentración de una sustancia en una solución, bajo esta necesidad, Arnold J. Beckman ,y sus colegas, crearon en 1940 el primer espectrofotómetro, el cual facilitó un análisis más rápido y preciso de las  muestras a estudiar en comparación a otros métodos.

La espectrofotometría relaciona la absorción de la luz por una sustancia y la concentración de esta en un medio, osea, consiste en la medición de la energía radiante que absorbe  una solución en función de la longitud de onda, donde el papel del espectrofotómetro es cuantificar la cantidad de energía absorbida (o transmitida, dependiendo del tipo de espectrofotómetro) por dicha solución que contiene a la vez una cantidad de soluto desconocida, usando como referencia una que contiene una cantidad conocida de dicho soluto, en otras palabras, el aparato detecta la cantidad de luz transmitida  a través de la solución en su celda, y la compara con la que se  absorbe a través de una solución de referencia denominada “blanco”  donde la  lectura, en este caso,  está dada en absorbancia, que es la porción de la luz incidente que logra atravesar una muestra, manteniendo una longitud de onda determinada. En la cuantificación de biomoléculas se utilizan distintos métodos para poder medir dicha concentración, para el caso de las proteínas, uno de los más conocidos es el método de bradford, que se basa en la adición de un colorante específico (coomassie blue G-250) en un medio acídico, donde se utiliza un espectrofotómetro para la medición, esto se lleva a cabo gracias a que la proteína a medir genera un complejo proteína-colorante, donde el colorante puede existir de 2 formas, las cuales son azul o naranja, todo esto en un medio ácido, donde las proteínas se unen a la forma azul generando el complejo y produciendo un cambio en el max de absorción desde 465 nm a 595 nm con cambios en la coloración. La medición de la concentración es posible gracias a la comparación con una curva estándar fabricada con BSA. nos queda claro que este no es el único método conocido para la medición de proteínas donde se ocupa un espectrofotómetro, también está el método de BCA o reacción de biuret, por ende, es importante conocer el funcionamiento de estos métodos y su posterior medición con el espectrofotómetro, también es necesario saber realizar una correcta curva de calibración y la misma calibración del espectrofotómetro. también  existen algunos ensayos colorimétricos que nos ayudan a determinar o identificar azúcares, pero existen limitaciones en estos, como la poca concentración de un azúcar en una situación que impide que estos métodos sean eficaces debidos a su sensibilidad. Para poder identificar el tipo de azúcar se pueden emplear métodos como la prueba de molish, que es una prueba general para carbohidratos, pero para poder obtener la concentración de dicha azúcar se deben emplear otros métodos, como lo es la prueba de dubois, que consiste en una coloración dada a la cantidad de azúcar en la solución que es medible por espectrofotometría, es decir, entender el funcionamiento y correcto uso del espectrofotómetro es vital para el cálculo de las cantidades de las biomoléculas, no solo proteinas y carbohidratos, sino que ácidos nucleicos y lípidos. Con respecto a los diferentes métodos que existen para la detección de biomoléculas, igualmente es necesario saber aplicarlos correctamente, y que de esto depende de que el trabajo con el espectrofotómetro sea exitosa en un laboratorio refiriéndonos a lo que es el primer paso de lo que se quiera  medir.

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