Fotocolorimetria y cuantificación de proteínas

Fotocolorimetría y cuantificación de proteínas en el suero sanguíneo Jeison Andrés Lozada Escobar-Carlos Andrés Jiménez Candela-Universidad Nacional Sede Medellín Ingeniería Biológica, Facultad de ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín jlozada@unal.edu.co-cjimez@unal.edu.co Enero 1-2019

RESUMEN: El presente trabajo se realizó con el objetivo de estudiar los principios básicos de absorbancia y fotocolorimetría, necesarios para determinar, el espectro de absorción de un compuesto coloreado (Albúmina + Reactivo de biuret), y encontrándose así la longitud de onda a la cual la absorbancia es mayor. Como la ley de Beer nos indica a mayor concentración más absorbancia por lo que se pudo calcular la concentración de albúmina en la solución, minimizando las desviaciones, preparando una curva de calibración por medio de soluciones patrón y de sus respectivas absorbancias, cuyas concentraciones se podrán deducir y serán próximas a las reales. PALABRAS CLAVE: Fotocolorimetría, Ley de Beer, Concentración, Albúmina, Proteínas, Absorbancia, Aislamiento. INTRODUCCIÓN: La fotocolorimetría es un método que sirve para hallar la concentración de diferentes muestras y para seguir el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática(Díaz et al., 2000), consistiendo en medir la intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios compuestos(Skoog, 2008) siendo la mayor absorción característica para cada compuesto, en el que varía su intensidad dependiendo de la concentración de este(Rubinson, 2000), sin embargo esta característica no está restringida a sustancias incoloras ya que se hacen reaccionar con una especie que genere un producto coloreado (García, 1996). Lo anterior es fundamental para aprender los principios básicos de la fotocolorimetría, usando este para determinar las concentraciones de muestras proteicas. Para conocer con precisión la energía de la transición que ha ocurrido en la molécula, es necesario determinar para ella una gráfica que relacione la intensidad de la energía que se va absorbiendo, con un barrido en la región del espectro que nos interesa (UV o visible o los dos), a esta gráfica se llama espectro de absorción (Díaz et al., 2000), que nos ayuda a determinar la concentración del compuesto o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético(Brunatti y Martin, 2010), en este caso determinaremos el espectro de absorción del compuesto coloreado. La intensidad de la energía absorbida depende del número de moléculas que sufren la transición electrónica a la ƛ, que a su vez ese número de moléculas depende de su concentración y de la longitud de la celda contenedora (Skoog, 2001), donde se buscó determinar la concentración desconocida de las muestras, para cual se necesitó la ley de beer, que por medio de las absorbancias de una muestra patrón y de la muestra problema, junto con la concentración patrón hallaremos la desconocida(estando a condiciones iguales) (Harvey, 2002).

Para determinaciones más precisas y minimizar las desviaciones de la ley de beer preparamos una curva de calibración, a partir de una serie de soluciones patrón como también de las muestras reales se les mide la absorbancia y con estos datos podemos crear un gráfico (Absorbancia vs. Concentración) la cual nos permite llevar las absorbancias reales y deducir sus concentraciones (Díaz et al., 2000). Las proteínas son un conjunto de macromoléculas de vital importancia en un gran número de organismos que conocemos actualmente, y desempeñan múltiples funciones como la de organizar estructuralmente tejidos como los músculos u órganos, servir a las células como medio de transporte, señalización e interacción célula-célula y célula-matriz, catalizan reacciones en todo el cuerpo, ayudan en la respuesta inmunitaria, entre otras. (Calvo, 2004) En general, están compuesta por cadenas de aminoácidos que van desde las decenas de estos, hasta las decenas o centenas de miles de unidades, todos unidos por enlaces peptídicos. Se pueden clasificar de acuerdo a si tienen presencia de grupos prostéticos, de acuerdo a su solubilidad (Albúminas, globulinas, prolaminas, histonas, glutelinas) y de acuerdo a su forma estructural (fibrosas, globulares) (Calvo, 2004) En esta práctica se cuantificaron las proteínas en el suero sanguíneo, en su gran mayoría albúmina y globulinas, mediante el método de biuret, solución que reacciona con los enlaces peptídicos de estas proteínas y aparte de indicarnos presencia de estas en el suero, al ser una solución que colorea el suero, se puede cuantificar espectrofotométricamente la concentración de estas proteínas en el suero (Murray, Bender y Botham, 2010). MATERIALES Y MÉTODOS: -Materiales: Practica 1: Fotocolorímetro, reactivo de biuret, solución patrón de albúmina 3 mg/ml, solución salina al 0.85%, muestras de concentración desconocida. Practica 2: Solución acuosa de NaCl al 0.9%, solución saturada de (NH4)2SO4, solución patrón de albúmina, solución de biuret, muestra de suero sanguíneo, centrífuga, fotocolorímetro. -Métodos: Para el desarrollo de las prácticas se dividieron los laboratorios en partes: -Determinación del espectro de absorción de la albúmina: se adiciono un ml de la solución patrón de albúmina, cuatro ml de biuret y uno de solución salina se agito y almacenó por veinte minutos para la formación del color; Se procedió a tomar las dos celdas del fotocolorímetro a una se le agregó el blanco y a la otra la solución coloreada de albúmina, llevándolas hasta las tres cuartas partes de su volumen. En el instrumento se seleccionó la absorbancia y se colocó la longitud de onda de cuatrocientos nm (nanómetros), se procedió a usar la primera celda de blanco para ajustar la lectura a cero, luego la solución coloreada y se comenzaron a registrar los valores de absorbancia que daba el instrumento cada 20 nm hasta llegar a la longitud de onda de setecientos nm (nanómetros) ajustando la absorbancia a cero en cada blanco. -Separación de las globulinas del suero: se vertió un ml de suero sanguíneo y cuatro ml de agua destilada en un tubo de centrífuga, se agregó lentamente con un gotero una solución saturada de sulfato de amonio y se agitó por inversión, hasta la formación de una solución lechosa (proteínas precipitadas), se dejó reposar por diez minutos y luego se centrifugó a 2500 rpm por quince minutos, usando las pipetas Pasteur se retiró el sobrenadante con el

cuidado de no perder el precipitado obtenido, posteriormente se disolvió con la adición de NaCl hasta completar cinco ml, llamando al tubo de ensayo como “solución de globulinas”. -Preparación de la solución de proteínas totales: se vertió en una probeta de 25 ml, 1 ml de suero sanguíneo, se le agrego solución salina hasta completar 20 ml, llamando al tubo de ensayo “solución de suero” -Medición de absorbancia de las soluciones de proteína: a cuatro tubos de ensayo se les rotuló y agregó a cada uno de los tubos lo que se indicó en la tabla, se agitó cada uno de los tubos y se dejó reposar en la oscuridad durante 20 min para su coloración, se seleccionó en el fotocolorímetro la longitud de onda de 540 nm y se llenó una celda con el blanco para ajustar la absorbancia a 0, posteriormente se midió las absorbancias del resto de los tubos, lavando la celda entre mediciones con agua destilada, para luego registrar los valores. -Preparación de la curva de calibración de la albúmina (esta fue realizada en las dos prácticas similarmente): Se rotularon 10 tubos de ensayo a los cuales se les adicionaron las soluciones indicadas en la tabla, se les agregaron a todos 4ml de biuret (incluyendo el blanco), se mezcló por inmersión para luego almacenarse en oscuridad durante 20 min, se seleccionó en el fotocolorímetro la longitud onda de máxima absorbancia y ajustando a cero el blanco se procedió a medir la absorbancia de todos los tubos, se determinó la concentración con la fórmula de dilución y se completaron los datos de la tabla. RESULTADOS:

Tubo Sol. patrón (mL)

Sol salina (mL)

Biuret (mL)

Abs (A)

[Con] (A)

Blanco 0 2,0 4 0 0

1 0,1 1,9 4 0,052 0,075

2 0,3 1,7 4 0,077 0,225

3 0,5 1,5 4 0,117 0,375

4 0,7 1,3 4 0,159 0,525

5 0,9 1,1 4 0,203 0,675

6 1,2 0,8 4 0,257 0,9

ƛ(nm) Abs (A) ƛ(nm) Abs(A)

400 0,174 600 0,173

420 0,117 620 0,131

440 0,094 640 0,090

460 0,108 660 0,053

480 0,137 680 0,033

500 0,178 700 0,015

520 0,215 720 0,007

540 0,232 740 0,004

560 0,228 760 0,005

580 0,206 780 0,004

Tabla 1.1 Absorbancia vs Longitud de onda

Tabla 1.2 Absorbancia y concentración de la solución de albúmina

Gráfica 1.1 Gráfica absorbancia vs longitud de onda

Gráfica 1.2 Absorbancia vs. Concentración

Tubo N° Rótulo

Solución de NaCl 0.9%

Solución de albúmina

Solución de globulinas

Solución de fresco

Solución de Biuret Abs(A)

1 Blanco 1,0 ml

4,0 ml 0

2 Gelatina

1,0 ml

4,0 ml 0,043

3 Globulinas

1,0 ml

4,0 ml 0,177

4

Prot. Totales

1,0 ml 4,0 ml 0,179 Tabla 2.1 Absorbancia de las soluciones de proteína

Gráfica 2.1 Absorbancia vs. Concentración Tubo Sol.

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