IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS ESPECÍFICAS POR WESTERN BLOT

PRACTICA 5

INMUNOBLOTING

IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS ESPECÍFICAS POR WESTERN BLOT

INTRODUCCIÓN

La presente práctica está diseñada en base a un estudio que se realizó en nuestro medio y que tenía como uno de los objetivos, demostrar que Uncaria tomentosa "uña de gato" induce apoptosis a través de la degradación de la proteína PARP (Poly ADP-ribosa Polimerasa). Cabe señalar, que en este caso no es la intención estudiar la apoptosis inducida por "uña de gato", sino que estamos tomando como modelo este estudio, a fin de mostrar la aplicación de la técnica de "Inmunoblotting" y por lo tanto para una buena comprensión e interpretación de los resultados que se obtuvieron, mencionaremos algunos detalles al respecto.

Uncaria tomentosa, comúnmente conocida como "uña de gato" es una liana perteneciente al género Uncaria, familia de las rubiaseas, que desde hace muchos años en el Perú se le emplea en la medicina popular en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades particularmente digestivas e inflamatorias; sin embargo, muchas de sus bondades no están aún del todo comprendidas.

Los modernos métodos de la biología molecular, que cada vez son más versátiles, ya que además de tener un alto grado de confiabilidad y especificidad pueden muy bien aplicarse a nuestra realidad, contribuyendo al conocimiento de muchos aspectos del quehacer científico. Por otro lado, la evaluación de las acciones farmacológicas y moleculares de muchos productos naturales son posibles de ser abordados usando el sistema de macrófagos de rata que se ha convertido en una valiosa herramienta en este tipo de estudios.

La  PARP (poli ADP-ribosa polimerasa), es una proteína de 116 kd que está involucrada en la reparación del ADN, esta proteína se ha convertido en un indicador de apoptosis, puesto que es degradada por la caspasa-3, la cual lo convierte en dos fragmentos: uno de 85 kd y otra de 31 kd.

 OBJETIVOS. 

1. Conocer el fundamento y los principios en que se basa la metodología del Western blot.
2. Conocer la utilidad de esta técnica en el campo de la investigación.

 TRATAMIENTO DE MACRÓFAGOS CON Uncaria tomentosa

Aproximadamente 2 x 106 macrófagos aislados fueron cultivados en placas Petri, conteniendo 10 ml de medio de cultivo (Buffer fosfato pH 7.2 suplementado con 10% de suero de bovino, penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 ug/ml) e incubados a 37°C en presencia y ausencia de U. tomentosa al 20 % durante 0, 6,12 y 24 horas.

[pic 1]

Obtención de macrófagos (articulo previo)

LISIS DE MACRÓFAGOS PARA EL ANÁLISIS DE PARP

a) Reactivos:

- Tampón de lisis:

NP-40                   1%

• Mezcla de inhibidores de proteasas para 1 ml

Pefabloc          100mg

• Tampon de carga "laemmli":

Azul de bromefenol 0.003 %

2-Mercaptoetanol 1%

a) Procedimiento:

Transcurridos los tiempos de incubación, se concentran las células de la placa por centrifugación a 3000 rpm durante 3 minutos. A continuación, el precipitado celular se resuspende y se lava 2 veces con PBS (Buffer fosfato pH

7.4) frió.

El precipitado celular se lisa con 100 ul de tampón de lisis y 5pl de la mezcla de inhibidores de proteasas en un baño de hielo. El homogenizado celular se centrifuga a 13000 rpm durante 20 minutos: Se determina luego la cantidad de proteínas totales en el sobrenadante por el método de Bradford. Alícuotas de sobrenadante conteniendo 10 ug de proteínas totales se diluyen en tampón de carga 2X y se incuban en baño hirviente durante 7 minutos. Luego se procede a la electroforesis de proteínas.

3.- Electroforesis de proteínas en gel de Poiíacrilamina. 

a)  Reactivos: 

• Acrilamida.bis acrilamida 30 %
• Tris-HCI 1.5 M pH 8.8
• Persulfato de amonio 10 %
• Temed
• Tris-HCI 0.5  MpH 6.8
• Tampón de corrida pH 8.3  Tris-HC1          25  mM

SDS                0.1 %

Glicina            250  mM

 b)  Procedimiento:

La electroforesis se realiza utilizando un gel de apilamiento de 4 % de poliacrilamida y un gel de separación al 12.5 %. Ambos geles se dejan polimerizar durante 45 minutos a temperatura ambiente. El sistema de geles se prepara utilizando el sistema mini-ROTEAN II; para ello, primero se prepara la solución separadora, dejándola polimerizar en el sistema. Para evitar el efecto inhibitorio del oxigeno atmosférico sobre la polimerización, se añaden con cuidado 500 u de agua desionizada sobre la solución una vez polimerizado, se elimina el agua y se añade la polución de apilamiento en la cual se construyen los Dosillos para las muestras.

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