Método de Lowry

Instituto Politécnico Nacional[pic 1][pic 2]

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica

 Laboratorio de Métodos de Análisis

[pic 3]

Alumna: Sánchez Ocaranza Jukari Jocelin

Grupo: 5QV1                 Sección: 2

Fecha de entrega: 22/ Agosto/ 2018

Profesora: Cinthya Salimah Martínez Reyes

Introducción.

Los métodos de determinación de proteínas totales están basados en sus características diferenciales respecto del resto de biomoléculas presentes en las muestras biológicas. Hay métodos que tienen su principio en presencia del enlace peptídico (métodos de Biuret, Lowry y de BCA), en la formación de complejos con determinados agentes (método de Bradford), etc.

En algunos casos es necesario que las proteínas reacciones con algún reactivo que les permita adquirir una característica que pueda medirse (como el color), para así poder ser cuantificadas analíticamente.  

El método de Lowry, es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de las mismas, según la Ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

1. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de Nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ - proteína, tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2. La reducción, se lleva a cabo con el reactivo de Folin- Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de la tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente de dicho reactivo es el ácido fosfomolibdico-fosfotúngstico (de color amarillo), que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato.

Objetivos.

• Elaborar y utilizar una curva de calibración que permita la cuantificación de proteínas.
• Conocer el efecto de sustancias no proteicas (interferencias), en el desarrollo de color, del método.
• Analizar las ventajas y desventajas del método, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.

Resultados [pic 4]

Figura 1. Curva de calibración de albumina, obtenida a partir de los valores de absorbancia a 590nm, de la serie a y b, donde la concentración de la proteína es conocida.[pic 5]

Tabla 2. Replicas para análisis estadístico

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico

Tabla 4. Efecto de las sustancias no proteicas en el método de Lowry

Discusiones

Curva de calibración

En la curva de calibración se puede observar como se cumple la Ley de Bouguer- Beer, ya que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, al menos entre 25 y 125 μg de la proteína. Esto se demuestra al obtener una línea recta con pendiente positiva a partir de los valores de absorbancia de la serie A y B.

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