Determinacion De Almidon

1. OBJETIVO

Establecer el método analítico para determinar el contenido de almidones en diferentes matrices de alimentos.

2. ALCANCE

Este protocolo es aplicable para la determinación de almidones totales presentes en yuca, batata y maíz y es específico para su cuantificación, omitiendo posibles azucares libres interferentes, que no pertenezcan a la forma almidón.

3. RESPONSABLES

Auxiliar de laboratorio.

Profesional encargado.

4. DEFINICIONES

ALMIDON: Es un polímero de α-glucosa en el que los monómeros se encuentran enlazados por enlaces 1- 4 (amilosa) lo que da lugar a una cadena lineal y ocasionalmente se ramifican formando un enlace adicional en posición 1-6 (amilopectina). Los almidones naturales contienen 10-20% de amilosa y 80-90% de amilopectina

AMILOSA: Las moléculas de amilosa consisten típicamente de 200 a 20,000 unidades de glucosa que se despliegan en forma de hélix como consecuencia de los ángulos en los enlaces entre las moléculas de glucosa.

Amilosa

AMILOPECTINA: La amilopectina se distingue de la amilosa por ser muy ramificada. Cadenas laterales cortas conteniendo aproximadamente 30 unidades de glucosa se unen con enlaces 1α→6 cada veinte o treinta unidades de glucosa a lo largo de las cadenas principales. Las moléculas de amilopectina pueden contener hasta dos millones de unidades de glucosa.

Amilopectina

ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS: Es una técnica que se emplea en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución. Funciona bajo el principio de que mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión:

HIDRÓLISIS ENZIMATICA: La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición de enzimas que catalizan o intervienen para que suceda. Por ejemplo: La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser catalizados por enzimas distintas.

5. MATERIALES Y EQUIPOS

5.1 MATERIALES:

• Tubos de ensayo pirex de 15mL

• Frasco ámbar

• Papel aluminio

• Papel de filtro Wathman Nº 1

• Balones aforados de 50mL

• Papel parafilm

• Espátula

• Termómetro

• Gradilla para tubos de ensayo

• Transferpipeta de 500 a 1000 μL

• Transferpipeta de 0,5 a 5mL

5.2 EQUIPOS:

• Balanza analítica

• Vortex

• Centrífuga

• Estufa de secado

• Baños de maria

• Espectrofotómetro UV-VIS

• Refrigerador

• Potenciómetro

• Timer

5.3 REACTIVOS

• Etanol

• α-Amilasa Termoestable en solución (3000 U/mL), marca SIGMA ref. A3306

• Acido acético glacial (d=1,05g/mL)

• Azida de sodio 99%

• Acido-3 Morpholinopropannosulfónico (MOPS) 99%

• Kit de Glucosa Oxidasa Peroxidasa (GOP) marca SIGMA Ref: GAGO20

• Amiloglucosidasa Aspergillus Níger solución marca SIGMA Ref: A9913

• Cloruro de Calcio (CaCl2) dihidratado.

• Glucosa

• 1M de HCl

• 1M de NaOH

• Agua desinoizada

6. METODOLOGÍA

6.1 PRINCIPIO DEL MÉTODO: Las muestras son hidratadas y el almidón presente es hidrolizado con la enzima α-amilasa rompiendo enlaces α-1,4. Posteriormente es ajustado el pH y la temperatura para realizar el rompimiento enzimático de los enlaces α-1,6 con amiloglucosidasa. La glucosa libreada reacciona con la glucosa oxidasa peróxidasa, que forma un complejo coloreado que es cuantificado por espectrofotometría UV-VIS a 540 nm.

6.2 CONDICIONES GENERALES DE OPERACIÓN: Se requiere de agua desionizada para la preparación de muestras y reactivos. Las muestras deben estar secas y finamente molidas. Las soluciones deben estar exentas de sólidos en suspensión. Se utilizan soluciones estándares a partir de glucosa.

LONGITUD DE ONDA (λ) RANGO LINEAL

540 nm

6.3 PREPARACIÓN DE LAS MUETSRA

6.4 REACCIONES:

Glucosa

Oxidasa

D-Glucosa + H2O D-Acido Gluconico+H2O

Reducida Peroxidasa Oxidada

H2O+ o-Dianisidina o-Dianisidina

(Incoloro) (Café)

H2SO4

o-Dianisidia oxidada o-Dianisidina oxidada

(Café) (Rosado)

6.4 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

6.4.1 Pesar 0,1 g de muestra sobre un tubo de ensayo de 15mL resistente a temperatura.

6.4.2 Adicionar 5mL de etanol del 80% y agitar en vortex por un minuto contabilizado.

6.4.3 Centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos. (1130 rpm por 20minutos)

6.4.4 Sacar suavemente el tubo de la centrífuga y con transferpipeta de 5 mL sacar el sobrenadante evitando la perdida del sólido precipitado.

6.4.5 Poner el tubo con la muestra a secar en estufa a una temperatura entre 55 y 60ºC durante 24 horas para eliminar totalmente el etanol adicionado.

6.4.6 Adicionar 3mL de solución de α-Amilasa Termoestable a la muestra y agitar en vortex para homogenizar (+/- 30 seg.).

6.4.7 Tapar tubo con papel aluminio e incubar por 2 minutos en baño de maria en ebullición (+/- 100ºC), sacar y agitar en vortex. Nuevamente incubar en baño de maria por 3 minutos.

6.4.8 Inmediatamente pasar el tubo a baño de maria con temperatura de 50ºC para estabilizar

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