Técnica Histológica (artificios O Errores)

Pasos de la técnica histológica

Obtención

Consiste en la provisión del material que se desea estudiar por medio del

microscopio. El método seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de

material. En todos los casos el instrumental con el cual se seccionan los tejidos debe

estar muy afilado para evitar aplastar sus elementos, así como se debe evitar

cualquier otro tipo de maltrato en su manipulación. Los principales métodos

empleados son: la biopsia, la resección quirúrgica y la autopsia.

- La biopsia consiste en la extracción de pequeños fragmentos de tejido de un

organismo vivo. Este procedimiento puede ser realizado de muy diversas formas,

consideraremos algunas:

- biopsia incisional : se realiza seccionando con instrumentos cortantes como el

bisturí.

- biopsia por punch : el punch es un instrumento filoso con forma de sacabocados

que se utiliza para tomar biopsias de piel.

- biopsia por punción : se realiza con agujas de biopsia y recientemente también

con agujas del tipo intramuscular (microbiopsia).

- biopsia endoscópica: se hace a través de endoscopios, que son instrumentos

flexibles que permiten la observación de algunas cavidades internas del organismo.

- La resección quirúrgica consiste en la extirpación de órganos completos o de

grandes partes de los mismos, a través de un procedimiento quirúrgico.

- La autopsia o necropsia es el examen de los órganos luego de la muerte,

generalmente con el objetivo de determinar las causas de la misma.

Cualquiera sea el procedimiento empleado para la obtención, el material que resulta

del mismo debe ser inmediatamente fijado o congelado para evitar los procesos de

autodestrucción de las células conocidos como autólisis.

Fijación

La fijación es en esencia un método para la preservación de la morfología y la

composición química de las células y los tejidos. Consiste en producir la muerte de

las células, de manera tal que las estructuras que poseían éstas en el estado viviente

se conserven con un mínimo de modificaciones, a lo largo del tiempo y de los

subsiguientes pasos de la técnica. Asimismo algunos métodos tratan de conservar

intacta su composición química.

La fijación debe realizarse inmediatamente de extraer las células del organismo, para

evitar las lesiones agónicas ocasionadas por la anoxia, que inicialmente producen

cambios osmóticos y luego alteraciones estructurales y bioquímicas más profundas,

fenómenos conocidos en conjunto como autólisis. Por el mismo motivo los fijadores

deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeños de tejidos (como regla

general menos de 1 cm cúbico), para que la difusión del fijador desde las superficies

hasta la parte central del bloque tisular se haga en un tiempo reducido.

Propiedades de los fijadores:

- Producen una rápida muerte celular, evitando la autólisis

- Preservan la morfología celular y tisular

- Preservan la composición química

- Penetran a los tejidos con relativa rapidez

- Facilitan la coloración posterior

- Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefacción

- Aumentan la consistencia de los tejidos

- Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos

- Efectos indeseables de algunos fijadores:

- Retraen los tejidos

- Precipitan en forma de cristales

- Endurecen demasiado las muestras

- Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas

- Producen alteraciones importantes a nivel molecular

- Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural

La elección del fijador adecuado está dictada por el propósito perseguido y para ello

deben tenerse en cuenta las propiedades y los efectos indeseables enumerados

arriba, que aparecen en mayor o menor medida en cada caso.

Clasificación general de los fijadores

- Físicos - Calor

- Desecación

- Microondas

- Químicos

simples

- Alcoholes - Metanol

- Etanol

- Aldehídos - Formaldehído

- Glutaraldehído

- Acidos - Acético

- Pícrico

- Osmico

- Sales - Bicromato de potasio

- Bicloruro de mercurio

- Mezclas de

químicos

- Carnoy - Alcohol etílico +

Acido acético

- Bouin - Acido pícrico +

Formol +

Acido acético

- Zenker - Bicromato de potasio +

Bicloruro de mercurio +

Acido acético

- FaGlu - Formaldehído +

Glutaraldehído

También debe considerarse:

- Su versatilidad para fijar distintos tipos de tejidos

- La facilidad para implementar su empleo

- Su estabilidad a temperatura ambiente

- Su costo comercial

Hoy en día el fijador histológico universal de mayor versatilidad frente a los

diferentes tejidos, de fácil utilización y económico, que cumple mejor con la

ecuación entre propiedades y efectos indeseables, es el formol diluído al 10 %,

especialmente si se lo prepara en una solución a pH neutro.

Revisión general sobre los diferentes tipos de fijadores

Los métodos físicos empleados para la fijación son el calor, la desecación y el

microondeado, aunque el frío se utiliza en ocasiones como alternativa a la fijación.

El calor produce artificios de retracción violentos y desnaturaliza severamente la

estructura proteica, por lo cual casi no se lo emplea. La desecación se emplea para

fijar extendidos celulares realizados directamente sobre los portaobjetos a partir de

material fresco (por ejemplo una gota de sangre).

El microondeado, recientemente incorporado como método de fijación, produce

agitación molecular a nivel de los dipolos que es más o menos homogénea en todo el

espesor de piezas de considerable tamaño. Su efecto se produce por una

combinación del calor generado en el tejido y la precipitación in situ de las proteínas

por ruptura de los puentes de hidrógeno.

Los métodos de congelación preservan la composición química pero no son en

sentido estricto métodos de fijación, aunque en algunos casos pueden utilizarse para

reemplazarlos. La metodología ideal para la congelación comienza con la

introducción de pequeñas piezas del tejido en un baño de isopentano, refrigerado

por nitrógeno líquido a una temperatura de -160 a 180° C. No causa retracción del

tejido; la preservación es homogénea en todo el espesor de la pieza; no hay

extracción de sustancias solubles; la composición química se mantiene

prácticamente sin cambios y la estructura, generalmente, se conserva con las muy

escasas modificaciones producidas por los cristales de hielo, que son menores

cuanto más rápida haya sido la congelación. La rapidez del congelamiento permite

también sorprender a las células en momentos críticos de su función, como en la

exocitosis de vesículas secretoras. Una de las mayores utilidades del sistema de

congelación es poder obtener rápidamente cortes histológicos durante una cirugía

para realizar un diagnóstico intraoperatorio, mientras el paciente permanece aún

anestesiado. En estas biopsias por congelación, donde la rapidez del diagnóstico

histopatológico es esencial para determinar la conducta quirúrgica, se utilizan por lo

general micrótomos de congelación refrigerados por la expansión de dióxido de

carbono líquido. La calidad de los preparados es apenas aceptable, pero suficiente

para los fines diagnósticos.

Algunos fijadores como el formol, el glutaraldehído, el bicromato y el bicloruro de

mercurio actúan formando puentes cruzados entre las proteínas y dando lugar a

fuertes uniones entre moléculas proteicas, siendo llamados por ello fijadores

generadores de puentes cruzados. En contraposición los alcoholes, la acetona y el

ácido acético precipitan las proteínas en su lugar por alteración de los puentes de

hidrógeno de las mismas sin dañar su estructura primaria y por ello se los denomina

fijadores coagulativos.

Para el estudio de la cromatina y los cromosomas se emplean frecuentemente los

fijadores ácidos (generalmente con ácido acético), y para el estudio de la actividad

enzimática se emplean la acetona, el glutaraldehído o al formaldehído, que preservan

muchos sistemas enzimáticos.

Las mezclas se utilizan para aprovechar las cualidades más sobresalientes de varios

fijadores a un mismo tiempo. Por ejemplo el Carnoy combina al etanol con el ácido

acético, ambos muy buenos fijadores para cromatina. El Bouin posee formol, fijador

universal con gran poder de penetración pero lento para actuar, con el ácido acético

de gran velocidad penetración y muy buen fijador nuclear, ambos sumados al ácido

pícrico que actúa principalmente a nivel citoplasmático. Se lo emplea mucho en

biopsias de médula ósea por ser además un buen decalcificador y en biopsias

testiculares por sus resultados empíricos.

Para microscopía electrónica se emplea la fijación con glutaraldehído, seguida con

una posfijación

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