Técnicas Histológicas, Artefactos, y Célula

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

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Instituto de Ciencias Biomédicas

Licenciatura en Nutrición

Protocolo # 2

“Técnicas Histológicas, Artefactos, y Célula”

Objetivo:

1. Explicar las diferentes técnicas de preparación de tejidos utilizadas en histología, particularmente la técnica de la parafina, desde la obtención del tejido hasta su observación al microscopio.
2. Aprender a identificar un artefacto y los diferentes tipos que podemos encontrar en una laminilla.
3. Conocer la morfología de las estructuras y orgánulos que forman la célula.

Técnicas histológicas (Técnica de la parafina):

        Las técnicas histológicas comprenden la preparación de tejidos para su estudio microscópico, lo que nos permite conocer la morfología macro y microscópica del órgano a estudiar. Dichos tejidos se pueden obtener de dos fuentes: la primera de ellas se obtiene directamente de pacientes sometidos a intervención quirúrgica, seleccionando una muestra de tejido de un órgano específico o una mínima porción de este; a esta muestra de tejido vivo se le llama biopsia. La segunda fuente de obtención de tejidos es post-mortem; puede ser llamada necropsia ya que es extraída de algún órgano durante una necrocirugía.

        Para la inclusión de muestras que serán observadas con el microscopio se utiliza sobre todo la técnica de la parafina. La parafina es una sustancia de aspecto ceroso. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C.

Materiales para la técnica de la parafina:

• Muestra de tejido
• Formol 10%
• Cassette de inclusión
• Canasta perforada
• Histoquinete
• Parafina
• Alcohol 96%, Xilol, Alcohol absoluto y Eosina
• Moldes cúbicos
• Micrótomo
• Agua
• Laminillas portaobjetos
• Horno
• Baño flotador
• Colorantes para teñir cortes de tejido (hematoxilina y eosina)
• Laminilla cubreobjetos
• Resina

Metodología para la técnica de la parafina:

1. Obtención del tejido: Las muestras de tejido son obtenidas por biopsia o necropsia.
2. Fijación: El tejido se debe sumergir inmediatamente para impedir cambios. El fijador penetra en el tejido y conserva sus componentes y estructura con las características lo más aproximadamente similares a las que tiene en vida. La solución más comúnmente utilizada es el formol al 10% aunque el porcentaje puede variar.
3. Sección del tejido: El órgano o segmento se secciona tomando cortes representativos con el fin de que las sustancias impregnen todas las células del tejido.
4. Proceso automatizado de fijación, deshidratación, aclaramiento e impregnación: Los tejidos seccionados se introducen a unas pequeñas capsulas perforadas, y estas capsulas a su vez en una canasta que ira colocada en un aparato llamado “Histoquinete”. Este instrumento se programa para que la canasta que contiene los tejidos sea sumergida en las diferentes sustancias contenidas en los recipientes del aparato.

• Fijación: Los dos primeros recipientes contienen formol al 10%.
• Deshidratación: Todos los tejidos son ricos en agua, el agua no se mezclará con parafina y al no hacerlo no se logrará incluir el tejido en parafina, por lo tanto será necesario retirar el agua del tejido. Esto se logra aplicando al tejido sustancias miscibles en agua como el alcohol etílico, agente deshidratante que auxiliará a sustituir el agua por parafina.
• Aclaramiento: El agua y el alcohol son insolubles en parafina, pero hay productos químicos solubles en ambos y se conocen como agentes aclarantes. Los aclarantes más usados son: Xilol, Tolueno, Cloroformo, Benceno y Aceite de Cedro. La canasta pasa por dos recipientes de Xilol para su aclaramiento, fenómeno que tiende a hacer transparentes a los tejidos.
• Impregnación en parafina: Los dos últimos recipientes son de metal y mantienen la parafina a una temperatura suficiente para conservarla liquida. Los espacios inter e intracelulares que naturalmente contenían agua serán ocupados por parafina con el fin de conservar la estructura celular lo más cercanamente posible a su aspecto natural.

1. Inclusión en bloques de parafina: Los tejidos recientemente procesados se colocan en el fondo de pequeños moldes cúbicos en los cuales se vierte parafina liquida. Se deja enfriar hasta que se solidifique y se extraen los bloques de los recipientes cúbicos.
2. Micro-corte de tejidos: Los tejidos son incluidos en parafina porque este compuesto presenta una consistencia específica la cual permite hacer al bloque cortes tan finos como de 3 a 10 micras. Para efectuar los cortes existe un instrumento llamado micrótomo, el cual tiene cuchillas finamente afiladas. Se coloca el bloque de parafina en el micrótomo haciendo que el bloque se deslice hacia arriba y abajo contra el filo, originando cortes consecutivos en forma de cinta.
3. Montaje en laminilla portaobjetos: La cinta de cortes se hace flotar en agua caliente con el fin de eliminar las arrugas de los cortes, una vez que se eliminan las arrugas, los cortes se colocan en laminillas portaobjetos.
4. Desparafinación: Los cortes montados en las laminillas aun contienen gran cantidad de parafina, cuyo exceso debe ser eliminado. Esto se logra sometiendo las laminillas a temperatura alta de hasta 70 o 80 grados centígrados con el fin de derretir la parafina y exponer al tejido. El portaobjetos se sumerge en un agente aclarante para disolver y extraer la parafina. Después se introduce en alcohol absoluto para disolver el aclarante, enseguida se introduce en soluciones de alcohol gradualmente menores y finalmente en un recipiente con agua. Si en este momento se observa el corte, este mostrara muy pocos detalles para interpretación, por lo que se tendrán que utilizar colorantes para mostrar sus características morfológicas específicas.
5. Tinción: La tinción que mayormente se utiliza en el laboratorio de histología se conoce bajo el nombre de hematoxilina y eosina. Las estructuras de los tejidos que se tiñen con colorantes básicos se conocen como “Basófilas”, tienen afinidad por la hematoxilina, colorante básico que tiñe en tono azul o purpura. Las estructuras de los tejidos que fijan colorantes ácidos se conocen como “Acidófilas”, tienen afinidad a la eosina, colorante acido que tiñe rosa o rojo.
6. Montaje del cubreobjetos: Los cortes tenidos son colocados en una laminilla cubreobjetos para su protección y conservación, con un adhesivo transparente y resistente que puede ser resina sintética, sustancia seleccionada por caracterizarse en tener un índice de refracción de la luz similar a la que el vidrio del porta y cubreobjetos refractan.

Artefactos:

        Durante la preparación de los cortes histológicos con la técnica de la parafina, específicamente durante el paso del montaje del tejido sobre el portaobjetos, es común que se generen ciertas fallas en la preparación. Los artefactos no son alteraciones que el tejido sufrió en vida, sino alteraciones posteriores debido a la manipulación humana al preparar los cortes imprecisamente. Un artefacto es una alteración no natural del tejido, generada artificialmente durante su preparación.

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