Bioquimica

Prácticas de Bioquímica

1ª práctica: día 25 de febrero de 1999.

Cromatografía en papel de aminoácidos.

Objetivo:

La separación de sustancias constituye una de las técnicas más utilizada en un laboratorio bioquímico. Una de las más usadas, es la cromatografía, que será una aproximación metodológica. En esta práctica se pretende conocer y entender la base de la cromatografía en papel y de separarar e identificarar aminoácidos.

Introducción:

Existen varios factores importantes en la separación de sustancias, como pueden ser: el reparto, la adsorción, el intercambio iónico,...etc. El factor predominante en esta técnica es el reparto entre dos fases no miscibles. El papel actúa como soporte inerte del vapor de agua ambiental, aunque también puede llevar a cabo otras funciones tales como movimiento capilar de los solutos (adsorción) y atracción debida a las impurezas polares del papel (intercambio iónico). Esa fase acuosa es la fase estacionaria (líquido polar sostenido en papel). La fase móvil es el solvente apolar que se deposita en la cubeta de cromatografía y que ascenderá por capilaridad por el papel. El reparto ocurrirá entre la fase acuosa estacionaria y el solvente o fase móvil. El soluto se mueve en la dirección de flujo del solvente a una velocidad que es regulada por su afinidad hacia la fase acuosa estacionaria o la fase orgánica móvil no polar. La afinidad del soluto por la fase móvil es prueba de una mayor velocidad de migración en la dirección del flujo.

Otros factores a destacar en la determinación de la velocidad de migración del soluto son: peso molecular, tipo de papel empleado, tamaño de la cámara, temperatura,... etc. La velocidad de migración del soluto en la dirección del flujo del solvente, viene determinada por lo que se denomina Rf, que es la distancia recorrida por el soluto, desde un punto de partida, dividido por la distancia recorrida por el frente del solvente.

Distancia recorrida por el soluto .

Rf = Distancia recorrida por el solvente

El Rf de cualquier soluto de un sistema no puede ser mayor de la unidad.

Protocolo experimental:

Aminoácidos a separar:

Aspártico.

Leucina.

Lisina.

Mezcla problema.

Reactivos:

Disolvente: etanol/agua/amoniaco (80/10/10)

Revelador: ninhidrina (se disuelve 200 mg en 100 ml de acetona conservado a 4 ºC).

Se ponen 50 ml de disolvente en la cubeta y se tapa. Se prepara el papel, de un tamaño aproximado a 12 x 27 cm. A 2 cm de uno de los extremos se traza una línea con lápiz y se marcan 4 puntos separados a igual distancia en los que se aplicarán unos µl de los 3 aminoácidos y de la mezcla problema. Se coloca el papel en la cubeta de tal manera que quede sumergida aproximadamente 0.5 cm y se tapa la cubeta.

Transcurridas unas 2 o 3 horas, cuando el disolvente ya ha alcanzado una altura significativa, se retira el cromatograma de la cubeta, se marca con lápiz el frente alcanzado por el disolvente y se seca en una estufa a 105 ºC durante 10 minutos.

Una vez seco el cromatograma se pulveriza con el revelador en una campana y de nuevo se introduce en la estufa, ahora 5 minutos.

Los aminoácidos se distinguen por la aparición de unas manchas púrpuras en el cromatograma.

Para calcular los Rf de cada uno de los aminoácidos, hay que determinar la distancia recorrida por el aminoácido. Se harán dos mediciones: una de la distancia recorrida por el aminoácido, tomando el centro de la mancha. Otra para la distancia recorrida por el disolvente, considerando la señal practicada con lápiz antes de secar el cromatograma.

Resultados de la práctica:

Aminoácido

D. aminoácido (D1)

D. disolvente (D2)

Rf=D1/D2

Aspártico

Lisina

Leucina

2.3 cm

7.2 cm

14.2 cm

17.5 cm

17.5 cm

17.5 cm

0.1314

0.4114

0.8114

En la mezcla problema se obtuvieron los tres aminoácidos, como se observa en el cromatograma adjunto.

Podemos comparar la polaridad de los aminoácidos, observando la distancia recorrida por cada uno de ellos en el cromatograma. A mayor polaridad menos distancia recorrerá, a la inversa, una mayor distancia recorrida indicará menor polaridad, por tener afinidad por la fase móvil.

La polaridad de los tres aminoácidos queda esquematizada de la siguiente manera:

Asp>Lis>Leu

El carácter ácido del ác. aspártico, se lo da su radical libre: CH2-COO¯

La lisina es una minoácido básico, cuyo radical libre es: CH2-CH2-CH2 -CH2 -H2N

La leucina es un aminoácido apolar, y su radical libre es: CH2 -CH-(CH3)2

Existen también cromatogramas descendente donde el eluyente se pone encima y va hacia abajo.

También hay cromatograma bidimensional: ascendente y descendente. El papel es cuadrado y se utiliza cuando queremos cuantificar y cualificar muchos aminoácidos. Se utilizan dos eluyentes de distinta polaridad.

2ª práctica: día 25 de febrero de 1999.

Cromatografía de filtración en gel.

Objetivo:

En esta prática se pretende conocer y entender la base de la cromatografía de filtración en gel, que separan moléculas en función de su tamaño.

Introducción:

La cromatografía de filtración en gel, también llamada de tamiz molecular, permite separar moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía se emplean geles que se componen de bolitas aproximadamente esféricas de un tamaño comprendido entre las 50 y las 200 µm de diámetro, formadas por una red tridimensional polimérica interconectada que da lugar a la formación de poros de un tamaño regular. La matriz polimérica es insoluble en agua, pero por su carácter hidrofílico se encuentra embebida por el disolvente.

Lo que sucede cuando se hace pasar por el gel en el tampón de elución una mezcla de moléculas de distintas tamaños es:

a)Las moléculas muy grandes, por tener un diámetro superior al de las microesferas, no puede difundir hacia su interior.

b)Las moléculas muy pequeñas difunden hacia el interior de los poros de las microesferas, quedando momentáneamente

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